יצירת תצורה של תאים שלמים להדמיית סידן דו-פוטון של פרוסות מוח

תקציר

מקור: Camiré, O., et al. הדמיית סידן של שני פוטונים בדנדריטים עצביים בפרוסות מוח. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים פרוטוקול לרישום מהדק טלאי של תא שלם והדמיית סידן של שני פוטונים בפרוסות בהיפוקמפוס במוח. שיטה זו מאפשרת ללמוד את הדינמיקה של Ca²⁺ transients המקומי (CaTs) בדנדריטים של סוגים עצביים שונים בפרוסות מוח חריפות.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הסקירה האתית המתאימה של בעלי חיים.

1. הכנה מקדימה (אופציונלי: הכנה יום מראש)

1. הכינו שלושה סוגים של תמיסת נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) (פתרונות רגילים, סוכרוז והתאוששות, 1 ליטר כל אחד; ראו טבלה 1). התאם את האוסמוליות של התמיסות ל- 300 ± 10 mOsm וקרר את ACSF-Sucrose עד לנקודת כמעט הקפאה (0-4 ° C).
   הערה: השימוש בתמיסת חיתוך דלת נתרן (ACSF-Sucrose) מסייע לשמר את יכולת הקיום של נוירונים בשכבות השטחיות של פרוסות חריפות.
2. הכינו 0.75 מ"ל של תמיסת טלאי המכילה פלואורופור אדום (לדוגמה, Alexa-594) ומחוון סידן סינתטי ירוק (לדוגמה, Oregon Green BAPTA-1; ראו טבלה 1). כלול ביוציטין (ראה טבלה 1) בתמיסת התיקון אם נדרש זיהוי מורפולוגי פוסט-הוק של תאים מתועדים.
3. התאם את האוסמוליות של התמיסה ל 280 ± 5 mOsm ו- pH ל- 7.35 ± 0.5. שמור את התמיסה במקרר או על קרח בכל עת.
   הערה: בחירת מחוון הסידן צריכה להתבסס על הטווח הדינמי שלו ועל אופי אירועי Ca²⁺ הנחקרים.
4. בעזרת מושך מיקרופיפטה, הכינו פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט (ראו טבלת חומרים) עם קצה ≈ 2 מיקרומטר (עמידות פיפטה של 3-5 MΩ) ופיפטות גירוי מנימי זכוכית תטא בורוסיליקט (ראו טבלת חומרים) עם קצה 2-5 מיקרומטר.
   הערה: הגדרות המושך ליצירת פיפטות בקוטר וצורה נתונים ייקבעו על ידי סוג חוט המושך ותוצאות בדיקת הרמפה עבור סוג זכוכית נתון.

2. הקלטות מהדק טלאי של תא שלם

1. הניחו פרוסת היפוקמפוס במקומה באמבטיה הממוקמת מתחת למטרה (הגדלה: 40x, צמצם מספרי: 0.8) של מיקרוסקופ דו-פוטוני סורק לייזר. יש לנקב ללא הרף את האמבטיה עם ACSF מחומצן המחומם בטמפרטורה של 30-32 מעלות צלזיוס בקצב של 2.5-3 מ"ל/דקה.
2. השתמש בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית אינפרא אדומה (IR-DIC) או במיקרוסקופ Dodt-SGC כדי לאתר תא מעניין באמצעות גודלו, צורתו ומיקומו.
   הערה: בהתאם לאוכלוסיית תאי העצב הממוקדת, מודל עכבר מהונדס יכול לשמש לאיתור תאים מעניינים בקלות. במקרה זה, שלב זה יכול להיות מוחלף עם שימוש במקור אור פלואורסצנטי.
3. מלאו פיפטת גירוי בתמיסת ACSF-Normal המכילה את הפלואורופור האדום (לדוגמה, Alexa-594).
4. הניחו את פיפטת הגירוי (המחוברת ליחידת גירוי חשמלי) על גבי הפרוסה כך שהקצה יהיה באותו אזור כמו התא המעניין.
5. לאחר מילוי פיפטת התיקון בתמיסת טלאי והצמדתה לשלב ראש, הניחו אותה מעל הפרוסה כך שקצהו יהיה ישירות מעל התא המעניין.
6. הכניסו מזרק לסטופקוק תלת-כיווני וחברו אותו לפיפטת המדבקה דרך צינור הפלסטיק. הזריקו לחץ חיובי קבוע לפיפטת המדבקה (≈ 0.1 מ"ל) באמצעות המזרק. שמור על הסטופר במצב "קרוב".
7. הפעל את מודול תוכנת בקרת המגבר ועבור למצב מהדק מתח על ידי לחיצה על כפתור "VC". פתח את תוכנת רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים (למשל, clampex) לרכישת אותות אלקטרופיזיולוגיים ולחץ על סמל "בדיקת ממברנה" כדי לשלוח ללא הרף פולס מתח מרובע (5 mV, 10 ms), הדרוש כדי לפקח על שינויים בהתנגדות פיפטה.
8. מנמיכים את פיפטת המדבקה עד שהיא נמצאת ממש על גבי תא היעד. בעת יצירת מגע עם קרום התא, הסר את הלחץ על ידי הפיכת הסטופרקוק למצב "פתוח".
   הערה: מגע עם קרום התא מזוהה כאשר רואים עלייה קטנה בהתנגדות פיפטה (≈ 0.2 MΩ), וכניסה קטנה על התא נגרמת על ידי לחץ חיובי.
9. יש להפעיל לחץ שלילי קל על פיפטת המדבקה באמצעות מזרק ריק המותקן בסטופרקוק עד שהתנגדות הפיפטה המסופקת על ידי התוכנה מגיעה ל-1 GΩ. בחלון 'בדיקת ממברנה' של תוכנת רכישת הנתונים, מהדק את התא ב -60 mV.
10. המשך להפעיל לחץ שלילי עד לפתיחת התא והשגת תצורת התא כולו. זיהוי מצב תא זה מבוסס על השינוי הפתאומי בהתנגדות פיפטה (מ 1 GΩ ל 70-500 MΩ בהתאם לסוג interneuron) ואת המראה של ארעיים קיבוליים גדולים בחלון "מבחן הממברנה".

3. סידן דו-פוטוני (Ca²⁺)הדמיה

1. אם אתם מעוניינים בתגובות הפוסט-סינפטיות המעוררות, הוסיפו את חוסם קולטני GABAA gabazine (10 מיקרומטר) ואת חוסם קולטני GABAB CGP55845 (2 מיקרומטר) לאמבט ACSF.
2. במודול תוכנת בקרת המגבר, הגדר את תצורת התיקון למהדק זרם על ידי לחיצה על כפתור "CC" ורשום את דפוס הירי של התא בתגובה להזרקות סומטיות של זרם דפולריזציה (0.8-1.0 nA, 1 שניות). המתן לפחות 30 דקות עד שהתא יתמלא במחוונים הקיימים בתמיסת התיקון.
   הערה: ניתן להשתמש בדפוס הירי של התא ובתכונות הפעילות שלו כדי לזהות את תת-הסוג שלו, למשל, תאים בעלי קוצים מהירים. חשוב שריכוז האינדיקטור יתייצב באמצעות דיפוזיה לפני שמתחילים לרשום מעברי סידן (CaTs) (ראה טבלה 2 לפתרון בעיות).
3. CaTs מעורר AP
   1. באמצעות תוכנת רכישת התמונות, התחל לרכוש תמונות. אתר דנדריט מעניין באמצעות האות הפלואורסצנטי האדום. כדי להבטיח תגובה נראית לעין, ראשית, בחר דנדריט פרוקסימלי (≤ 50 מיקרומטר) מכיוון שהיעילות של התפשטות לאחור של AP עשויה לרדת באופן משמעותי עם המרחק בנוירונים בין-עצביים GABAergic.
   2. באמצעות 'הכלי המלבני' בתוכנת רכישת התמונה, התקרבו לאזור היעד ועברו למצב "xt" (linescan). מקם את הסריקה על פני הענף הדנדריטי של עניין. עם בקרי עוצמת הלייזר בתוכנת הרכישה, הגדר את הלייזר בעל שני הפוטונים ברמת הספק מינימלית שבה פלואורסצנטיות ירוקה בסיסית נראית רק מעט כדי למנוע רעילות אור.
   3. בתוכנת רכישת הנתונים לאלקטרופיזיולוגיה 'פרוטוקול' חלון ותוכנת רכישת תמונה, צור ניסוי הקלטה של משך הזמן הרצוי המכיל הזרקת זרם סומטי של המשרעת הרצויה.
      1. באמצעות תוכנת רכישת התמונה, לחץ על כפתור "התחל רשומה" ורכוש את הפלואורסצנטיות ברציפות במשך 1-2 שניות. חזור על רכישת התמונה 3-10 פעמים. המתן לפחות 30 שניות בין סריקות בודדות כדי למנוע נזק לאור. אם אתם רוכשים קווים במספר נקודות לאורך הדנדריט, קחו אותם בסדר אקראי כדי למנוע השפעות סדר.
4. CaTs מעורר סינפטית
   1. אתר דנדריט מעניין באמצעות האות הפלואורסצנטי האדום.
   2. מניחים את פיפטת הגירוי על פני השטח של הפרוסה מעל הדנדריט של עניין. הורידו באיטיות את פיפטת הגירוי למקומה, מזערו את התנועה כדי למנוע הפרעה לתצורת התא כולו. מקם את פיפטה על 10-15 מיקרומטר מן הדנדריט.
   3. כדי להמחיש את מיקומם של מיקרו-דומיינים סינפטיים בדנדריטים אספיניים, בתוכנת רכישת התמונה, עבור למצב 'xt' (linescan) ומקם את הקו לאורך ענף העניין הדנדריטי.
   4. בחלון 'פרוטוקול' (של תוכנת רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים) ותוכנת רכישת תמונה, צור ניסוי הקלטה המפעיל את יחידת הגירוי לאחר תחילת הניסוי.
   5. באמצעות תוכנת הרכישה, לחץ על כפתור "התחל רשומה" כדי לסרוק לאורך הדנדריט ברציפות במשך 1-2 שניות. חזור על הרכישה 3-5 פעמים, המתן 30 שניות בין סריקות כדי למנוע photodamage.
      הערה: ניתן לכוונן את אורך הסריקה בהתאם לקינטיקה של האירוע המעורר, אך יש למזער אותה כדי למנוע נזק לאור (ראה טבלה 2 לפתרון בעיות).
   6. חזור על שלב 3.4.5 בתנאים שונים (למשל, עוצמה/אורך גירוי שונים, הכנסת חוסם תרופתי וכו') בהתאם לשאלה הספציפית המטופלת.
   7. עצור את הרכישה כאשר התא מראה סימנים של הידרדרות בבריאות: דפולריזציה מתחת ל -45 mV, עלייה ברמת Ca²⁺ הבסיסית, הידרדרות מורפולוגית של דנדריטים (למשל, blebbing, פיצול; ראה טבלה 2 לפתרון בעיות).
   8. כדי לקבל מידע ראשוני על המורפולוגיה של התא ולשמור תיעוד של מיקום פיפטת הגירוי, רכשו ערימת Z של התא בתעלה האדומה. באמצעות תוכנת הרכישה במצב 'xyz', הגדר את מגבלות המחסנית העליונה והתחתונה כדי לצלם את התא כולו עם כל התהליכים הכלולים. הגדר את 'גודל המדרגה' על 1 מיקרומטר והתחל את רכישת המחסנית באמצעות כפתור "התחל רשומה".
   9. לאחר השלמת רכישת Z-stack, השתמש באפשרות "הקרנה מרבית" בתוכנה כדי להציג את כל תוכניות המוקד של המחסנית ולאמת את איכות הרכישה. לאחר מכן, שלפו באיטיות את פיפטת המדבקה מהפרוסה.
   10. כדי לתקן את הפרוסה לצורך זיהוי מורפולוגי פוסט-הוק, הוציאו במהירות את הפרוסה מהאמבטיה בעזרת מברשת צבע שטוחה והניחו אותה בין שני ניירות סינון בצלחת פטרי מלאה ב-ACSF. החלף את ACSF בתמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) והשאר את התבשיל בחדר או במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.

טבלה 1: מתכוני תמיסה. תרכובות וריכוזים לתמיסות המשמשות במהלך הפרוטוקול.

פתרון תיקון מבוסס

תמיסה	רכיב	ריכוז (mM)
ACSF-Normal	NaCl	124
	KCl	2.5
	NaH2PO4	1.25
	MgSO4	2
	NaHCO3	26
	גלוקוז	10
	CaCl2	2
ACSF-Recovery	NaCl	124
	KCl	2.5
	NaH2PO4	1.25
	MgSO4	3
	NaHCO3	26
	גלוקוז	10
	CaCl2	1
ACSF-Sucrose	KCl	2
	NaH2PO4	1.25
	MgSO4	7
	NaHCO3	26
	גלוקוז	10
	סוכרוז	219
	CaCl2	1
K+	K+-גלוקונאט	130
	HEPES	10
	MgCl2	2
	פוספוקריאטין די(טריס)מלח	10
	ATP-טריס	2
	GTP-Tris	0.2
	ביוציטין	72
	אלקסה-594	0.02
	אורגון גרין-BAPTA-1	0.2

טבלה 2: טבלת פתרון בעיות. פתרונות לבעיות נפוצות שעלולות להתעורר במהלך ניסוי הדמיה Ca²⁺.

בעיה	תמיסה
לא מסוגל לתקן נוירון בריא	בדוק סימנים לכך שהפרוסות אינן בריאות: תאים מכווצים או נפוחים, גרעינים גלויים וכו '. אם כן, השליכו את הפרוסות. כמו כן, ודא את התנגדות פיפטת הטלאים ואת האוסמוליות של תמיסת התיקון; החלף אותם אם הערכים אינם בטווח המתאים.
האות הפלואורסצנטי מדנדריטים נמוך	המתן זמן רב יותר עד שהתא יתמלא. אם חסימה מונעת מתמיסת המדבקה להתפזר לתוך התא, נסו להפעיל כמות קטנה של לחץ שלילי בפיפטת המדבקה.
גירוי חשמלי אינו מעורר תגובת Ca2+	בדוק נוכחות של חפץ בהקלטה האלקטרופיזיולוגית. אם נעדר, בדוק אם יש תקלה בקצר/ביחידה מעוררת. אם קיים, העלה את עוצמת הגירוי או קרב את פיפטת הגירוי לדנדריט. יש לציין כי המרחק בין אלקטרודת הגירוי לבין הדנדריט לא יעלה על 8 אום כדי למנוע דפולריזציה ישירה של דנדריטים בעת לימוד תגובות סינפטיות.
אות Ca2+ מעורר גבוה מדי/רווי את מחוון Ca2+	הפחת את עוצמת הלייזר. אם הבעיה נמשכת בתאים מרובים, השתמש במחוון Ca2+ אחר עם זיקה נמוכה יותר של Ca2+.
אות Ca2+ הבסיסי גדל בהדרגה במהלך הניסוי	המתן פרק זמן ארוך יותר בין סריקות בודדות. אם קו הבסיס עדיין גדל, עצור את הרכישה; זה מצביע על כך שבריאות התא ככל הנראה מתדרדרת.
המשרעת של אות Ca2+ פוחתת במהלך סריקות	הפחת את עוצמת הלייזר או הקטן את התצוגה (אם רלוונטי).
דנדריט מתפצל ("blebbing") לאחר סריקה	הפחת את עוצמת הלייזר או הקטן את התצוגה. אם הדנדריט מוגבל לדנדריט הממוקד, בחר דנדריט אחר והפחת את עוצמת הלייזר / התרחקות. אם מספר דנדריטים מתפוצצים, עצרו את הרכישה.
אותות פלואורסצנטיים "נסחפים" אל מחוץ לקו הסריקה לאחר טאטוא	הפחיתו את התנועה בפרוסה על ידי הפחתת מהירות זילוח ACSF. לפני התיקון, ודא כי הפרוסה קבועה היטב במקומה על ידי רשת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זן בעלי חיים: עכבר CD1	Charles נהר	22
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	C4901
D-(+)-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8270
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375
מגנזיום כלורי	סיגמא-אולדריץ'	M8266
מגנזיום גופרתי heptahydrate	סיגמא-אולדריץ'	230391
אבקת פרפורמאלדהיד, 95%	סיגמא-אולדריץ'	158127
אשלגן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	P3911
אשלגן גלוקונאט	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1847
נתרן אזיד	סיגמא-אולדריץ'	S2002
סודיום ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	S8875
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	S5886
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S9378
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	T9284
בסיס טריזמה	סיגמא-אולדריץ'	T1503
טריזמה הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	T3253
נתרן פוספט דיבייסיק דיהידראט	סיגמא-אולדריץ'	71643
נתרן פוספט monobasic מונוהידראט	סיגמא-אולדריץ'	S9638
ביוציטין	סיגמא-אולדריץ'	B4261
אלקסה פלור 594 הידרזיד	תרמופישר סיינטיפיק	A10438
SR95531 (Gabazine)	אבקאם	dorit_120042
אדנוזין טריפוספט (ATP)-טריס	סיגמא-אולדריץ'	A9062
גואנוזין (GTP)-Na+	סיגמא-אולדריץ'	G8877
אורגון גרין BAPTA-1	תרמופישר סיינטיפיק	O6812
מלח פוספוקריאטין די(טריס)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1937
אלקסה-546 מצומדת סטרפטאווידין	תרמופישר סיינטיפיק	S11225
תיקון בורוסיליקט נימי זכוכית	מכשירים מדויקים בעולם	1B100F-4
נימי זכוכית תטא בורוסיליקט	סאטר אינסטרומנט	BT-150-10
P-97 מושך מיקרופיפטה בוער/חום	סאטר אינסטרומנט
מיקרוסקופ קונפוקלי מולטיפוטון TCS SP5	לייקה מיקרוסיסטמס
זיקית Ultra II Ti:ספיר לייזר מולטיפוטון	קוהרנטית
תוכנת LAS AF Imaging Acquisition	לייקה מיקרוסיסטמס
בקר טמפרטורה TC-324B	וורנר אינסטרומנטס
מגבר MultiClamp 700B	התקנים מולקולריים
Digidata 1440A Digitizer	התקנים מולקולריים
מתרגם קונפוקלי	סיסקיו
מיקרומניפולטור	סיסקיו
pClamp תוכנה לרכישת נתונים	התקנים מולקולריים
A365 מבודד גירוי זרם קבוע	מכשירים מדויקים בעולם
טבלה אופטית Vibraplane	מערכות קינטיות