כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הרכבת פיפטת הזרקת הקלטה
- משוך נימי זכוכית באורך של כ-7 ס"מ (קוטר חיצוני של 1 מ"מ) באמצעות מושך פיפטה.
- שברו את קצה הנימים ובדקו את הצמצם תחת מיקרוסקופ אור. אשר כי הקוטר הפנימי הוא בין 30 מיקרומטר ל 40 מיקרומטר.
- הכניסו חוט כסף באורך 7 ס"מ לתוך נימי הזכוכית כאשר כ-1 ס"מ בולט מהקצה הלא מחודד של פיפטת הזכוכית.
- כופפו את חוט הלהט העודף בצורה אורתוגונלית לנימי הזכוכית.
- החל טיפה של דבק פלסטיק גמיש על פיר של מחט היפודרמית 30 גרם.
- הכנס מחט היפודרמית 30 G לפיפטת הזכוכית בהתאם לסכמות המוצגות באיור 1.
- הוסיפו ציפוי דבק שני כדי להבטיח איטום תקין מהצומת שבין פיפטת הזכוכית למחט ההיפודרמית.
- השאירו את הפיפטה להתייבש כשהקצה פונה כלפי מעלה למשך כ-12 שעות כדי להבטיח ריפוי דבק תקין. התוצאה הסופית מוצגת באיור 2.
הערה: הליך זה נעשה בניסויים חריפים, ואין צורך בעיקור קצה הפיפטה.
2. הכנת בעלי חיים
- הכניסו את החולדה לקופסת הרדמה.
- יש להשרות הרדמה באמצעות איזופלורן 4% למשך 5 עד 10 דקות.
- הניחו את בעל החיים על שולחן סטריאוטקסי עם כרית חימום ובדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס. השתמש חרוט אף עם 2% isoflurane כדי לשמור על הרדמה. אבטחו את ראש החולדה באמצעות מוטות אוזניים ומחזיק שיניים.
- יש למרוח משחה אופתלמית או טיפות עיניים, כולל טיפות אטרופין 1%, כדי לסייע בהרחבת האישון. למניעת יובש, יש למרוח טיפות סיכה כל 30 דקות בקירוב.
- לגלח את הראש ולנקות אותו עם 10% פובידון-יוד.
- להרדמה מקומית, יש להזריק 0.5 מ"ל של 2% לידוקאין מתחת לקרקפת ב-2-3 מקומות על ידי הרמת העור והחדרת קצה המחט.
- לאשר רמה נאותה של הרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן והתבוננות חוסר תנועה. בנוסף, יש לנטר את קצב הלב כדי לוודא שהוא נמצא בערכים נורמליים (300 עד 400 פעימות לדקה).
- חתכו את הקרקפת בקו ישר לאורך החציון עם להב אזמל #10 כדי לחשוף הן את התפרים העטרתיים והן את התפרים הסגיטליים.
- חשוף את נקודות הלמבדה והברגמה על ידי דחיפת הרקמה המכסה את הגולגולת במרית כירורגית.
- יישור הגולגולת כך שעמדות ברגמה ולמבדה יהיו באותו מישור.
- כדי להגדיר את נקודת ההתייחסות, השתמש במכשיר סטריאוטקסי עם צינור זכוכית מותקן כדי למקם אותו ממש מעל ברגמה. זה יהיה ה"אפס" עבור קואורדינטות המדידה הקדמית והמדיאלית-לטרלית.
- הגדר את נקודת העניין על ידי הזזת התושבת הסטריאוטקסית לקואורדינטות הנדרשות, שים לב לקואורדינטות הסטריאוטקסיות, וצייר ריבוע סביב אזור המטרה המסמן היכן תבוצע הקרניוטומיה.
- השתמש במקדחה כירורגית עם מקדחה מעוקרת לאורך הריבוע המסומן באיטיות ללא לחץ כדי להסיר את חומר העצם. היזהר לא לקדוח זמן רב מדי באותו אזור, כפי שהוא יפיק חום ולגרום נגעים על קליפת המוח.
- כאשר העצם התוחמת את craniotomy הפך דק מספיק, בזהירות להסיר את החלק הגולגולתי עם פינצטה לחשוף את קליפת המוח.
- לעתים קרובות להשקות את קליפת המוח החשופה עם נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה כדי למנוע התייבשות רקמות.
הערה: הסרת דורא מאטר מיותרת על החולדה מכיוון שקצה ההזרקה חזק מספיק כדי לחדור.
3. מילוי והרכבה של מערכת ההזרקה
- ממלאים את המיקרומזרק 5-10 μl על ידי שאיפה עם שמן מינרלי.
- מלאו את המחט ההיפודרמית בפיפטת זכוכית קבועה בתמיסה של 0.5% Chicago Sky Blue (CSB) ו-300 μM חומצה γ-אמינובוטירית (GABA) או תמיסה של 2% לידוקאין עם 0.5% CSB 9. לדלל את כל התמיסות עם מלוחים.
- במקרה של חומר שופע, למלא באמצעות מזרק רגיל ולהשתמש בטכניקות מניעה הרגיל כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר.
- במקרה של חומרים יקרים יותר, שמן מינרלי יכול לשמש כדי למלא את הזרקת, ואת הסוכן הכימי יכול להיות הציג על ידי שאיפה. הפרש הצפיפות בין שמן מינרלי למים גבוה יחסית, ולכן חומר זה הוא מועמד טוב להזרקת תמיסות מימיות.
הערה: ניתן להוסיף צבע כדי לאשר את ההפרדה בין שני הנוזלים.
- כדי למלא את פיפטה הזרקת, לשאוף מזרק 1 מ"ל עם הפתרון לאט להזריק אותו לתוך פיפטה.
- שימו לב היטב לדליפות באזורים המסומנים באיור 1 על-ידי ניקוי האזורים האלה וצפייה בדליפות על-ידי הזרקת התמיסה באיטיות עם המזרק.
- הסר את מזרק 1 מ"ל. כאשר עושים זאת, לשמור על לחץ קל על הבוכנה, כך ואקום לא להסיר את הפתרון מן פיפטה ההזרקה.
- שואפים את microsyringe עם שמן מינרלי לצרף אותו בחוזקה פיפטה הזרקת מלא. לאחר מכן, בזהירות לנגב כל פתרון עודף מן ההזרקה התאספו עם גזה.
- הזריקו נפח קטן מאוד, מספיק כדי לראות טיפה קטנה נוצרת בקצה פיפטת הזכוכית, כדי לוודא שהקצה אינו חסום.
- הרכיבו את ההזרקה על מערכת המיקרו-משאבה וודאו שהיא קבועה היטב.
- מקם בזהירות את קצה ההזרקה בקואורדינטות המטרה והורד את הקצה לפני השטח של קליפת המוח.
- הורידו לאט לאט את ההזרקה באמצעות המנגנון הסטריאוטקסי למבנה המטרה (קוליקולוס עליון) באמצעות הקואורדינטות האנטומיות המתאימות.
- כסו את קליפת המוח החשופה באגר חם כדי למנוע התייבשות רקמות.
4. הזרקה והשבתה הפיכה
- הגדר את משאבת המיקרו-הזרקה להזריק 400 עד 800 nl ב- 40 nl/min ולחץ על Run כדי להתחיל את ההזרקה. שים לב שקצב הזינוק יראה ירידה במהלך ההזרקה.
הערה: במערך הניסוי, הפעילות העצבית התאוששה תוך שעה לאחר סיום אספקת GABA. ניתן להשתמש בכל מכשיר מכני מכויל כדי להפעיל לחץ על מזרק המיקרו-הזרקה ולבצע את ההזרקה.
- לאחר קבלת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, יש להרדים באמצעות שיטה שאושרה על ידי הקהילה המקומית לאתיקה של בעלי חיים.
