הקלטת זרמים של תאים שלמים עם התנשפות GABA בפרוסת מוח של עכבר

תקציר

מקור: Feng, Y. et al., Whole-cell Currents המושרה על ידי יישום נשיפה של GABA בפרוסות מוח.J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את ההקלטה של זרמים שלמים בתאים המושרים על ידי חומצה גמא-אמינובוטירית, או GABA, בפרוסת מוח קליפת המוח הקדם-מצחית של עכבר. העברה מבוקרת של GABA פותחת תעלות כלוריד בנוירון פוסט-סינפטי, ויוצרת זרמים פוסט-סינפטיים מעכבים, או IPSCs. IPSCs אלה גדלים עם ריכוזי GABA גבוהים יותר, המשקפים את הפעילות המעכבת של GABA על שידור סינפטי.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנת פתרונות

1. להכין 500 מ"ל של נוזל מוחי מלאכותי סטנדרטי (ACSF) המכיל את הרכיבים המתוארים בעבודתנו שפורסמה כמפורט בטבלה 1.
   1. השתמשו בכוסות זכוכית נקיות עם מים נטולי יונים, להכנת תמיסת ACSF טרייה. יש לנקות מריות עם מים נטולי יונים, ולייבש לפני השימוש להוספת נתרן כלורי (NaCl), אשלגן כלורי (KCl), די-מימן נתרן פוספט (NaH₂PO₄), נתרן דו-פחמתי (NaHCO₃), מגנזיום גופרתי (MgSO₄), D-גלוקוז, ולהוסיף את הסידן כלוריד (CaCl₂) לאחר בעבוע התמיסה עם 95% O₂ / 5% CO₂תערובת במשך ~20 דקות (כמפורט בטבלה 1) עד 500 מ"ל של מים נטולי יונים. מערבבים עד להמסה מלאה.
   2. ודא שה-ACSF צלול לחלוטין ללא משקעים. לאחר מכן, התאם את ה- pH ל- 7.2-7.4. בועה עם תערובת גז המורכבת מ 95% O₂ ו 5% CO₂ במשך ~ 20 דקות.
2. הכינו 250 מ"ל של תמיסת חיתוך פרוסות המכילה את הכימיקלים המתוארים בטבלה 2.
   1. הוסף KCl, מגנזיום כלורי (MgCl₂), NaH₂PO₄, NaHCO₃, כולין·Cl ו-D-גלוקוז והוסף את הסידן כלורי (CaCl₂) אחרון כמצוין ב-1.1.1, ל-250 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה והמיס כמתואר ב-1.1.1 וב-1.1.2.
   2. לאחר בעבוע עם 95% O₂/5% CO₂, מניחים את התמיסה במקפיא למשך 15-20 דקות, כך שתמיסת החיתוך הופכת קרה כקרח וקפואה חלקית.
      הערה: אנו משתמשים בתמיסת חיתוך זו בעת הכנת פרוסות מעכברים בני חודש-חודשיים; הנוסחה עשויה להיות שונה עבור עכברים מעל חודשיים.
   3. הכינו תמיסת ליפופוליסכריד (LPS) על ידי המסתה במי מלח איזוטוניים סטריליים נטולי אנדוטוקסין (0.9% NaCl). LPS מנוהל תוך צפקית (0.5 מ"ג/ק"ג) ומתחיל להקליט שעתיים מאוחר יותר.

2. הכנת פרוסת קליפת המוח הקדם-מצחית

1. הוציאו את תמיסת החיתוך מהמקפיא והפכו להומוגניים לקבלת רפש. מניחים את התמיסה על קרח ומבעבעים כל הזמן עם 95% O₂/5% CO₂.
2. בעזרת מספריים גדולים וחדים, ערפו במהירות את ראשו של עכבר כמתואר והכניסו מיד את הראש לתוך מלאה בתמיסת חיתוך קרה כקרח (0-4 מעלות צלזיוס).
3. חותכים את החלק העליון של הגולגולת לאורך קו האמצע בכיוון קאודלי לאף עם מספריים עדינים ומסירים את חלקי הגולגולת הרוחביים. מוציאים את המוח עם מרית דקה ויורדים לתמיסת חיתוך קרה כקרח.
   הערה: שלבים 2.2-2.3 חייבים להיעשות במהירות (רצוי < דקה).
4. הניחו את המוח על מכסה צלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ מלאה בקרח. שטפו את המוח בתמיסת חיתוך קרה כקרח. חותכים את המוח הקטן ואת נורת הריח עם סכין גילוח.
5. יש למרוח דבק ציאנואקרילט על בעל הדגימה של ויברטום. הניחו בזהירות את בלוק המוח על טיפת הדבק, הצד הרוסטרלי כלפי מעלה, ומיד טבלו בתמיסת חיתוך קרה כקרח.
6. כוונן את מחזיק הלהב של הוויברטומה לזווית של 15° תוך התייחסות למישור האופקי והכן פרוסות מוח קורונליות של 350 מיקרומטר (תדר רטט להב = 85 הרץ, מהירות = 0.1 מ"מ לשנייה).
7. בעזרת פיפטה, מעבירים את הפרוסות לתא התאוששות מלא ACSF, דוגרים במשך שעה אחת (ב-RT) עם בעבוע קבוע של 95% O₂/5% CO₂.

3. הקלטת תיקון תא שלם

1. הכינו מיקרופיפטות בורוסיליקט מזכוכית לשימוש כאלקטרודות הקלטה או מיקרופיפטות נשיפה בהתאם להנחיות הספציפיות במדריך ההפעלה של Puller. עבור אלקטרודות הקלטה, התנגדות החוד היא בטווח 4-6 MΩ, בעוד מיקרופיפטות נשיפה יש קוטר קצה בטווח 2-5 מיקרומטר.
2. הוסף חוסם תעלות Na⁺ (טטרודוטוקסין (TTX), 1 מיקרומטר), כדי לחסום ערוץ Na⁺ מהיר ובכך פוטנציאלי פעולה, ל- ACSF ולשמור על קצב זרימה קבוע של תמיסה זו של 2-3 מ"ל לדקה בתא ההקלטה, על ידי שאיבה פריסטלטית לתוך התא ושאיפה החוצה ממנו. ערבבו את ה-ACSF עם 95% O₂/5% CO₂ כל הזמן כדי להבטיח את הכדאיות של הפרוסות.
3. מעבירים פרוסת מוח לתא ההקלטה באמצעות פיפטת פסטר שעברה שינוי שקצהו הדק נחתך כך שיתאים לגודל הפרוסה. מכסים את הפרוסה בעוגן פרוסת פלטינה בחוטי ניילון מקבילים במרווחים של ≥2 מ"מ זה מזה כדי להחזיק את הפרוסה על הרציף.
4. מלאו את מיקרופיפטת ההקלטה בתמיסה פנימית (טבלה 3) ומלאו את המיקרופיפטות הנפוחות בחומצה גמא-אמינובוטירית (GABA) ב-10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר (מומס ב-ACSF), או ACSF כבקרת רכב.
5. כדי למנוע חסימה עם לכלוך, הפעל לחץ חיובי קל באמצעות מזרק 1 מ"ל לפני טבילת אלקטרודת ההקלטה ב- ACSF. באמצעות מיקרומניפולטור מתחת למיקרוסקופ (עדשה אובייקטיבית 4x), מקמו את אלקטרודת ההקלטה ואת המיקרופיפטה כך שהקצוות יופיעו במרכז תמונת הווידיאו בצג (איור 1A).
6. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ (עדשה אובייקטיבית 40x) תוך הנמכה הדרגתית של מיקרופיפטת הנשיפה והנח אותה מעל נוירון ההקלטה בזווית של 45°. שמרו על המרחק בין קצה המיקרופיפטה הנשיפה לבין תא העצב שנרשם בין 20 ל-40 מיקרומטר (איור 1B). לאט ובזהירות לגשת לנוירון עם אלקטרודת ההקלטה ולאחר מכן לשחרר את הלחץ החיובי. יש למרוח יניקה חלשה וקצרה דרך הצינור המחובר למחזיק האלקטרודות ליצירת אטם ג'יגה-אוהם.
7. שמור על המתח ב 0 mV. לאחר היווצרות חותם ג'יגה-אוהם, לפצות על קיבוליות מהירה ואיטית באופן ידני או אוטומטי. לאחר מכן החל יניקה קצרה וחזקה דרך הצינור שהוזכר לעיל כדי להיכנס למצב תא שלם.
8. הקלט eIPSC במצב מהדק מתח. הפעילו לחץ גז נמוך (חנקן, 4-6 psi) על מיקרופיפטת הנשיפה באמצעות פיקושפריצר הנשלט על-ידי מחולל שלב מתח מאסטר 8 כדי לספק נשיפות GABA בודדות או זוגיות (איור 2).

טבלה 1. הקלטת ACSF.

חומר	גר'/מול	ריכוז (mM)	משקל (גר'/ל')
NaCl	58.443	119	6.9547
KCl	74.551	2.5	0.1864
נה"ה 2ת.ד. 4	137.99	1	0.1380
NaHCO3	84.007	26.2	2.2010
מגסו4	120.366	1.3	0.1565
D-גלוקוז	198.17	11	2.1799
CaCl2	110.98	2.5	0.2775

טבלה 2. פתרון חיתוך פרוסות.

חומר	גר'/מול	ריכוז (mM)	משקל (גר'/ל')
KCl	74.551	2.5	0.1864
MgCl2	95.211	7	0.6665
נה"ה 2ת.ד. 4	137.99	1.25	0.1725
NaHCO3	84.007	25	2.1002
כולין·Cl	139.63	115	16.0575
D-גלוקוז	198.17	7	1.3872
CaCl2	110.98	0.5	0.0555

טבלה 3. פתרון פנימי להקלטות טלאים של תאים שלמים.

חומר	גר'/מול	ריכוז (mM)	משקל (גר'/ל')
גלוקונאט Cs	328.052	100	32.8052
CsCl	168.36	5	0.8418
HEPES	238.301	10	2.3830
MgCl2	95.211	2	0.1904
CaCl2	110.98	1	0.1110
באפט"א	476.433	11	5.2408
Na2ATP	551.1	4	2.2044
Na2GTP	523.2	0.4	0.2093

תוצאות

איור 1. דיאגרמה של מיקרופיפטה נשיפה ואלקטרודת הקלטה.
(A) המרחק בין הנשיפה לבין מיקרופיפטות ההקלטה. (ב) מיקרופיפטת הנשיפה (משמאל) ואלקטרודת ההקלטה (מימין) על פני השטח של פרוסת מוח.

איור 2. חסימת פיקרוטוקסין של IPSC המושרה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זכוכית Borosilicate micropipettes	מכשירי תריס	BF150-86-10	קוטר חיצוני 1.50 מ"מ; קוטר פנימי 0.86 מ"מ
Micropipette Puller	מכשירי תריס	דגם P-97	מושך מיקרופיפטה בוער/גבות
מיקרומניפולטורים	מכשירי תריס	MP-285
מגבר נשלט מחשב	התקנים מולקולריים	Multiclamp 700B
מערכת רכש דיגיטלי	התקנים מולקולריים	Digidata 1440A
מצלמת הדמיה	ניקון	2115001	ציוד בדיקה
מיקרוסקופ	ניקון	ליקוי חמה FN1
מאסטר 8	א.מ.פ.י.	מאסטר-8 ממריץ דופק
Vibratome Slicer	לייקה	VT 1000S
Picospritzer	פרקר חניפין		מערכות לחץ לפליטת נפחי פיקוליטר בחקר התא
סכין גילוח	ג'ילט	74 שניות	הנשר המעופף
צג וידאו	פנסוניק	WV-BM 1410
502 דבק	מעדן	7146	דבק ציאנואקרילט
משאבה פריסטלטית	שנגחאי JIA PENG תאגיד	BT100-1F
מצלמת וידאו	אולימפוס אמריקה מדיקל	אולי-150
העברת פייפטים	ביולוג'יקס	30-0138A1