$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. פתרונות חיצוניים ופנימיים
- השתמש בתמיסת רינגר של יונקים במהלך דיסקציה של הרשתית וכפתרון חיצוני ברישום אלקטרופיזיולוגי עוקב. הכינו את תמיסת רינגר היונקים מתמיסת מלאי פי 10 (ללא סידן) ביום ההקלטה, והוסיפו CaCl2 טיפת חלב לאחר 15 דקות של קרבוגניזציה (95% O2 ו-5% CO2). הפתרון הסופי 1x מכיל (ב mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0.8 Na2HPO4, 0.1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 ו 10 D-glucose.
- השתמש בשני פתרונות פנימיים כדי לאפיין תנודות SAC. בדוק את התועלת של תמיסות מוכנות בהקלטות הידוק מדבקות ממושכות של תאים שלמים על תאי גנגליון רשתית של עכבר בוגר (RGCs) ואחסן את האצוות המאומתות ב- 500 μl aliquots ב- -20 °C עד לשימוש.
- להקלטת תנודה פוטנציאלית של הממברנה, השתמש בתמיסה פנימית מבוססת אשלגן המכילה (ב- mM): 125 K-gluconate, 8 NaCl, 4 אדנוזין טריפוספט (ATP)-Mg, 0.5 Li-guanosine triphosphate (GTP), 5 אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), 10 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) ו 0.2% biocytin (w / v). התאם את ה- pH ל- 7.3 עם KOH.
- להקלטת זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ומעכבים, השתמש בתמיסה פנימית מבוססת צזיום המכילה (ב-mM): 100 Cs-methanesulfonate, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0.5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES ו-0.2% ביוציטין (w/v). התאם את ה- pH ל- 7.3 עם CsOH.
2. הכנה ליום ההקלטה
- כדי להכין קרום ניטרוצלולוז עם חורים פתוחים, ניקבו ידנית את הממברנה עם אגרוף מותאם אישית העשוי ממחט מזרק 16 G קהה ושטחו את הממברנה בין שתי פלטות זכוכית נקיות. עבור רשתית הרכבה שלמה, ליצור חור מרכזי בקוטר 0.2 מ"מ ולהקיף אותו על ידי 4 חורים גדולים יותר בקוטר 1-1.2 מ"מ.
- כדי ליצור חוט מילוי אחורי מותאם אישית לטעינת תמיסה פנימית לאלקטרודות, המיסו קצה פיפטה של 10 μl באמצע והאריכו בעדינות את החלק המומס עד שהוא מתקרר ומתקשה. ממש לפני השימוש, השתמשו בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את חוט הלהט עד שהוא מעט ארוך יותר מפיפטות המדבקה.
- משוך פיפטות טלאי במושך ניתן לתכנות מצינור זכוכית בורוסיליקט עם חוט להט פנימי. לייצר את micropipettes ביום הניסוי ולהשתמש בהם מיד.
הערה: להקלטת SACs, אנו משתמשים בהגדרת המושך הבאה: חום: 484; משיכה: 0; מהירות: 25; זמן עיכוב: 1; לחץ: 400 וערך רמפה של 462. הקוטר החיצוני (O.D.) והקוטר הפנימי (I.D.) של צינורות הבורוסיליקט הם 1.65 מ"מ ו-1.0 מ"מ, בהתאמה. ההתנגדות של פיפטות הוא 10-14 MΩ.
- שעה לפני קצירת הרקמות, הפשירו צינור של תמיסה פנימית על ידי ניעור על מערבולת למשך >30 דקות.
3. דיסקציה של הרשתית
- מרדימים את בעל החיים על ידי 4% איזופלורן בחמצן עד שהחיה מאבדת את תגובתה לצביטת בוהן. להקריב את החיה על ידי נקע צוואר הרחם.
- חתכו את שני גלגלי העיניים מעצבי הראייה במרחק של 1-2 מ"מ מראשי עצב הראייה בעזרת מספריים ישרים של הקשתית.
- גלגלו את גלגלי העיניים על מגבת נייר נקייה כדי להסיר דם ולאחר מכן טבלו אותם בתמיסת רינגר של יונקים קרבוגניים. ניקבו חור בלימבוס עם מחט 23 גרם וחתכו את גלגלי העיניים על ידי חיתוך לאורך הלימבוס עם מיקרו-מספריים. הסירו את הקרנית והעדשה בעזרת מלקחיים עדינים.
- להרכבה מלאה של הרשתית, קלפו בעדינות את כל הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי בעזרת מלקחיים עדינים ובצעו ארבעה חתכים אורתוגונליים בקוטר 1.5-2 מ"מ מהקצה לכיוון ראש עצב הראייה.
- טבלו קרום ניטרוצלולוז מנוקב לתוך הצלחת וגררו בעדינות את הרשתית מעליה כששכבת תאי הגנגליון (GCL) כלפי מעלה. מקם את ראש עצב הראייה לתוך החור המרכזי בעת הכנת רשתית הרכבה שלמה. מעבירים את הממברנה עם הרשתית לצלחת נקייה אחרת. שטחו בעדינות את הרשתית בעזרת מברשת צבע עדינה כך שתיראה כמו צלב מלטזי והניחו את כל ארבעת הקצוות מעל החורים.
- אם יש לבדוק חלק קטן מהרשתית בכל פעם, חתכו כל עין שהוכנה משלב 3.3 ל-3-4 חתיכות עם סכין גילוח עם שאריות אפיתל פיגמנטי מחוברות. הגן על החלקים שאינם בשימוש מפני אור בתמיסה חיצונית קרבוגנית והשתמש בהם תוך 12 שעות.
- כתם את קרום הניטרוצלולוז עם פיסת נייר סינון יבש והסר את הזגוגית והקרום המגביל הפנימי בעזרת מלקחיים ומברשת צבע.
- ודא שכל קצוות הרשתית מחוברים במלואם לממברנה לפני העברת המכלול לתא ההקלטה עם כיסוי זכוכית אטום בתחתית. הדקו את הממברנה עם שומן ואקום להחלקת הכיסוי והחזירו את הרשתית לנוזלים עם התמיסה החיצונית. היזהרו לא ללכוד בועות אוויר מתחת להרכבה.
- הניחו את החדר על במה של מיקרוסקופ זקוף. יש לנקב את התא בתמיסה חיצונית קרבוגנית חמה (34-35°C) בקצב של ~3 מ"ל לדקה.
- בחנו תחילה את הרשתית תחת עדשה אובייקטיבית 10x, ולאחר מכן השתמשו בעדשת טבילת מים 60x כדי לראות נוירונים GCL ושכבה גרעינית פנימית (INL) תחת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ו/או אפיפלואורסצנציה. כדי להמחיש SACs המבטאים tdTomato, השתמש במקור אור דיודה פולטת אור לבן (LED) בשילוב עם מסנן עירור של 554 ננומטר ומסנן פליטה של 581 ננומטר.
4. הקלטת מהדק טלאי של תא שלם מרשתית בהרכבה שטוחה
- סנן את התמיסה הפנימית דרך מסנן מזרק לתוך חוט המילוי המותאם אישית.
- הכנס את חוט הלהט לתוך מיקרופיפטה שזה עתה נמשכה והוציא את התמיסה הפנימית ליד הקצה עד שהתמיסה מכסה את חוט אלקטרודת הכסף למשך >5 מ"מ. הדקו את המיקרופיפטה למחזיק אלקטרודות עם מוט יניקה, שדרכו ניתן לכוונן את הלחץ בתוך האלקטרודה על ידי דחיפה או משיכה של הבוכנה של מזרק פלסטיק 10 מ"ל המחובר לצינור.
- מצא את פיפטה מתחת למטרה והורד אותה ל~ 100 מיקרומטר מעל הרשתית. במצב עוקב זרם (I = 0), השתמש בקיזוז DC כדי לאפס את אות מתח ה- DC העומד. מדוד את התנגדות פיפטה במצב מהדק זרם (IClamp) על ידי הזרקת זרמי גל ריבועי משרעת קבועה דרך פיפטה בזמן שהיא באמבטיה ונטרל את ההבדל על ידי סיבוב ידית Raccess. השתמש בקריאה על ידית Raccess כדי לחשב התנגדות פיפטה על ידי חוק אוהם.
- לאט לאט להביא את האלקטרודה ~ 10 מיקרומטר מעל הרשתית. הפעל לחץ חיובי על האלקטרודה. צפו בהשתקפות משתנה ליד קצה הפיפטה כשהיא מתקרבת לרשתית. במהירות אך בעדינות לדחוף את פיפטה לתוך GCL ולהפחית את הלחץ החיובי מיד.
- הזיזו את הפיפטה לכיוון תא עצב מסומן. הימנע ממגע עם נוירונים אחרים, כלי דם וכפות רגליים של תאי מולר. הפעילו לחץ חיובי יותר במידת הצורך כדי למנוע סתימת אלקטרודות.
- מקם את קצה פיפטה קרוב לקו האמצע של תא עצב מסומן עד לגומה גלויה. שחררו את הלחץ החיובי ואפשרו לקרום הפלזמה לקפוץ חזרה אל קצה הפיפטה.
- החל זרמים שליליים של 20 עד 120 pA על פיפטה כדי לסייע ביצירת חותם ג'יגה-אוהם. החל יניקה עדינה במידת הצורך כדי למשוך את קרום הפלזמה לתוך פיפטה. יש להמתין 5 דקות לאחר היווצרות האטם כדי לקרוע את קרום התא. זה מאפשר לתמיסה הפנימית שנשפכה להתפנות על ידי עירוי. קרע את הממברנה על ידי יניקה עדינה.
- לאחר הקרע בקרום ובמצב המהדק הנוכחי, הפעל את איזון הגשר וכוונן אותו באמצעות ידית Raccess.
הערה: עבור תא קטן כמו SAC, נדרשת התאמה קלה בלבד, אם בכלל. לחלופין, רשום זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ומעכבים במצב מהדק מתח (VClamp) על ידי החזקת התא בפוטנציאלי היפוך של כלוריד (בסביבות -75 mV) וגלוטמט (סביב 0 mV), בהתאמה. בדוק והתאם את מיקום פיפטה במידת הצורך כדי להתאים לסחף מזדמן של הרשתית ו / או מיקרומניפולטור.
- כדי לתעד את פוטנציאל הממברנה או את השינוי הנוכחי לפני, במהלך ואחרי הטיפול התרופתי, הכינו חוסמים סינפטיים (למשל, ציאנקוויקסאלין [CNQX], (2R)-אמינו-5-פוספונופנטנואט [AP5], פיקרוטוקסין, טובוקוררין וכו') ומודולטורים של תעלות (למשל, פלופירטין, דופמין, חומצה מקלופנמית וכו') טריים ביום הניסוי ממלאי קפוא. לדלל את התרופות עם פתרון רינגר קרבוגני. החל אותם באופן אצווה באמצעות זילוח.
- לאחר ההקלטה, להסיר בעדינות את פיפטה מן הסומה. מעבירים את המכלול מהחדר לצלחת נקייה. נתקו וחברו מחדש את הרשתית לקרום ניטרוצלולוז שטוח אחר ללא חורים מנוקבים כדי להבטיח שטיחות הרשתית במהלך הקיבוע.