רישומים אלקטרופיזיולוגיים להערכת התחדשות עצבית בפרוסות חוט שדרה בתרבית משותפת

תקציר

מקור: Heidemann, M., et al. Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מציג הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מתרביות אורגנוטיפיות של פרוסות חוט השדרה, שצולמו באמצעות מערך מרובה אלקטרודות או מכשיר MEA. הקלטות אלה מעריכות התחדשות עצבית בין הפרוסות. הפעילות החשמלית המסונכרנת שנצפתה מאשרת רגנרציה עצבית מוצלחת.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הרכבת פרוסות רקמת חוט השדרה על MEAs

1. מחממים מדיום מזין סטרילי באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, מכסה לא מוברג קלות לחמצון).
2. מקם את המערך הרב-אלקטרודות או MEA בפינצטה סטרילית עם קצוות מכוסים גומי בטמפרטורת החדר (RT) בצלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ סטריאו כאשר מערך האלקטרודות ממוקד. מרכז טיפת 6 μl של פלסמת עוף על מערך האלקטרודות הנקי, נטול האבק והסטרילי. בעזרת מרית קטנה, החליקו בזהירות שני חלקי חוט שדרה עם דפנות גחון הפונות זו לזו לתוך טיפת הפלזמה. אין לגעת באלקטרודות עם המרית.
3. מוסיפים 8 μl של תרומבין סביב טיפת פלזמה עוף. בעזרת קצה פיפטת הטרומבין, מערבבים בזהירות ומפזרים את תערובת הפלזמה/טרומבין סביב שתי הפרוסות. שוב, אין לגעת ישירות במערך האלקטרודות השביר. רגע לפני הקרישה, יש לשאוף עודפי פלזמה/תרומבין עוף.
4. מכסים את צלחת הפטרי כדי לשמור על לחות גבוהה בזמן שמכלול MEA / תרבית יושב כשעה בתא לח בתוך האינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס.
5. מוסיפים בזהירות 10 מיקרוליטר של חומר מזין לתא התרבית, מכסים את צלחת הפטרי ומחזירים לאינקובטור למשך כ-30 דקות.
6. הכניסו כל מכלול MEA/תרבית עם קצוות סטריליים מכוסים גומי לתוך צינור רולר, הוסיפו 3 מ"ל של חומר מזין וסגרו היטב את המכסה. מניחים את צינור הרולר בתוף הגלגלת, מסתובבים ב 1 - 2 סל"ד באינקובטור באטמוספירה המכילה 5% CO₂ ב 37 ° C.
7. שנה מחצית מהמדיום התזונתי לאחר 7 ימים במבחנה (DIV) ולאחר מכן 1-2 פעמים בשבוע.

2. נגעים מכניים

1. הוציאו את מכלול MEA/תרבית עם קצוות סטריליים מכוסי גומי מצינור הרולר והניחו בצלחת פטרי ללא מדיום מזין תחת מיקרוסקופ סטריאו כשהרקמה ממוקדת. ודאו חזותית ששתי הפרוסות מאוחות.
2. החזיקו את מכלול MEA/תרבית יציב על ידי הנחת פינצטה עם קצוות מכוסים גומי על MEA.
3. מניחים להב אזמל בחריץ של MEA קרוב לפרוסות הרקמה. החזק את האזמל בצורה אופקית למדי.
4. הרימו את ידית האזמל כלפי מעלה, אך הניחו ללהב האזמל להישאר בחריץ של ה-MEA באופן כזה שהלהב "מתגלגל" מהבסיס לקצה ובכך חותך את הרקמה המכסה את החריץ.
5. חמור כל שאריות רקמה חיבורים עם קצה מחט 25 G במידת הצורך. יש לעבוד רק באזור שבתוך החריץ ולא לגעת בקצוות העדינים.
6. החזירו את מכלול MEA/תרבית לצינור הרולר. לספק 3 מ"ל של מדיום מזין טרי לתרביות ולהחזיר אותם לתוף הרולר באינקובטור.

3. רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילות ספונטנית

1. כדי לחקור רגנרציה תפקודית בין שתי פרוסות חוט השדרה לאחר המספר הנבחר של DIV, הרכיבו את מכלול MEA/תרבית בתא הקלטה במיקרוסקופ והשתמשו בתמיסה חוץ-תאית של כ-500 μl (ראו רשימת חומרים).
2. המתן 10 דקות לפני ההקלטה הראשונה כדי לאפשר למערכת להתייצב.
3. הקלט פעילות ספונטנית בסיסית 2x במשך כ-10 דקות מכל אלקטרודה לזיהוי פעילות של MEA ב-RT.
4. כדי להבטיח תנאים יציבים וחוץ-תאיים, החליפו תמיסה חוץ-תאית לאחר כל הקלטה.
5. כדי לנטרל את הרשת, יש למרוח תמיסה חוץ-תאית המכילה סטריכנין (1 מיקרומטר) וגבזין (10 מיקרומטר). המתן לפחות 2 דקות לפני תחילת ההקלטה.

4. ניתוח נתונים

הערה: לזיהוי פוטנציאלי הפעולה החוץ-תאיים שנרשמו, השתמש בגלאי המבוסס על סטיות תקן ובמבחין עוקב עבור כל אלקטרודה.

1. הציגו את הפעילות העצבית שזוהתה של כל אלקטרודה בתרשים רסטר בהתאם לנהלים סטנדרטיים (איור 1F).
2. קבע והצג את פעילות הרשת הכוללת עבור כל פרוסה על-ידי סיכום מספר האירועים בערוצים המתאימים בתוך חלון הזזה של 10 מילישנייה, המוזז בצעדים של 1 msec (איור 1G).
3. לזהות בכל פרוסה התפרצויות בודדות (אשכולות של פעילות המופיעים על מספר אלקטרודות). לכן, הגדר סף פעילות שיא מינימלי בפעילות הרשת הכוללת המתאימה והגדר כל התחלה של פרץ וסוף פרץ. לדוגמה, סף מתאים הוא 25% ממשרעת הפרץ הממוצעת, וניתן להגדיר התחלה של פרץ כאירוע הראשון בחלון זמן של לפחות 5 מילישניות, והתפרצות מסתיימת בכך שהיא האירוע האחרון בחלון זמן של 25 מילישניות לפחות.
4. כדי לכמת רגנרציה פונקציונלית, חשב את אחוז ההתפרצויות המסונכרנות בין שתי הפרוסות. לשם כך, חשב את ההשהיה בין פרץ בפרוסה אחת לבין הפרץ הבא בפרוסה השנייה.
   הערה: זוג פרץ נקרא "מסונכרן" כאשר ההשהיה קטנה מאורך הפרץ הממוצע. במיוחד בתרבויות משותפות עם פעילות רבה, קיימת האפשרות ששני הצדדים יוזמים במקרה פרץ בחלון השיהוי שנבחר. עובדה זו צריכה להילקח בחשבון בכימות אחוז התפרצויות מסונכרנות.

תוצאות

איור 1. הצגה וניתוח של פעילות ספונטנית. (A) דיאגרמה של MEA. האלקטרודות המכוסות פלטינה מתוארות בשחור, החוטים השקופים באדום, והחריץ באמצע MEA בצהוב. (B) צילום תקריב של מערך האלקטרודות הממוקם במרכז MEA. (C) תמונת שדה בהיר של תרבות ישנה של 8 DIV. הפרוסות גדלו והתמזגו לאורך הצדדים זה מול זה. הפס הצהוב מייצג את החריץ נטול האלקטרודות והבידוד של MEA. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר (D) ציר הזמן של הניסויים. שתי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערך רב-אלקטרודות מישורי	Qwane Biosciences		מיוצר בהתאמה אישית בהתאם לעיצוב המעבדה שלנו
מדיום תזונתי			עבור 100 מ"ל
Dulbeccos שינה את המדיום של הנשר	גיבקו	31966-021	80 מ"ל
נסיוב סוסים	גיבקו	26050-070	10 מ"ל
מים מזוקקים וסטריליים			10 מ"ל
גורם גדילה עצבי-7S [5ng/mL]	סיגמא-אולדריץ'	N0513	200 מיקרוליטר
			מיוצר מחדש בתמיסת שטיפה עם 1% BSA
ג'ל מטריצה חוץ-תאי	BD Biosciences	356230	חייב להישאר קר בכל עת; לדלל 1:50 עם מדיום מותאם עבור נוירונים טרום לידתי ועוברי
תמיסה חוץ-תאית (pH 7.4)			[מ"מ]
NaCl			145
KCl			4
MgCl2			1
CaCl2			2
HEPES			5
נא-פירובט			2
גלוקוז			5
גבזין	סיגמא-אולדריץ'	SR-95531
מיקרופיפטה	World Precision Instruments, Inc.	MF28G-5
סטריכנין	סיגמא-אולדריץ'	S0532	רעיל
צינור שטוח תרבית רקמה 10 (= צינור רולר)	טכנו מוצרי פלסטיק AG	91243