עירור חיצוני של תרביות עצביות חד-ממדיות

תקציר

מקור:Stern, S., et al. עירור חיצוני של נוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים בתרבויות חד-ממדיות ודו-ממדיות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים טכניקה לגירוי תרביות עצביות בדוגמת קו עם שדה חשמלי אחיד וחד-כיווני.

פרוטוקול

1. הדמיה של פעילות ספונטנית או מעוררת בתרביות עצביות עם צבעים פלואורסצנטיים.

1. הכינו תמיסה של 50 מיקרוגרם צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן (ראו טבלת חומרים/ריאגנטים) ב-50 מיקרוליטר DMSO (דימתיל סולפוקסיד).
2. הכינו תמיסת הקלטה חוץ-תאית (EM) המכילה (ב-mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-גלוקוז, 45 סוכרוז (pH 7.4).
3. לדגור על תרבית עצבית ב 2 מ"ל EM עם 8 μL של תמיסת צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן במשך 1 שעות. להגן מפני אור ולסובב בעדינות כדי להבטיח התפשטות הומוגנית של הצבע לתאים.
4. החלף את התמיסה ב- EM טרי לפני ההדמיה. הדמיה פלואורסצנטית מודגמת באיור 1.
5. תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים אופטיים להדמיית סידן פלואורסצנטי (שיא עירור ב-488 ננומטר, שיא פליטה ב-520 ננומטר), באמצעות מצלמה ותוכנה המסוגלת לכמת את עוצמתו של כל אזור עניין (ROI) בשדה הראייה של המיקרוסקופ.

2. גירוי חשמלי של תרבויות

הערה: ההגדרה הבסיסית לגירוי חשמלי מוצגת באיור 2. פתק כיסוי שעליו גדלה התרבית העצבית במשך כ -14 יום מונח בצלוחית פטרי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפעילות החשמלית של תאי העצב מדומה באמצעות צבעים רגישים לסידן, בעוד מתח מופעל באמצעות שני זוגות אלקטרודות אמבטיה הממוקמות מחוץ לתרבית. האלקטרודות מונעות על ידי מחולל אותות שתפוקתו מוגברת על ידי מגבר דו-ערוצי. בקרת מתח לגירוי עדיפה על בקרת זרם סטנדרטית יותר, מכיוון שווקטורי השדה החשמלי נקבעים ישירות, ובכך מאפשרים חיבור ושילוב וקטורי פשוט. זה דורש בדיקה זהירה של אחידות השדה החשמלי, אשר ניתן לבצע על פני כל המדגם במקרה של בקרת מתח. בעת השימוש בבקרת מתח יש להקפיד להימנע מלולאות הארקה ויש לאמת את ההומוגניות של השדה החשמלי.

1. עבור גירוי חשמלי עם שדה חשמלי הומוגני להשתמש זוג חוטי אלקטרודה מקבילים.
   1. השתמש אלקטרודות עשוי פלטינה עם עובי בסדר גודל של 0.005 אינץ '(127 מיקרומטר). בעת שימוש עם כיסויי 13 מ"מ, ודא שהמרחק בין שתי האלקטרודות הוא סביב 11 מ"מ, ומקם את האלקטרודות 1 מ"מ מעל התרבית.
      הערה: כדי ליצור את מחזיק האלקטרודות (איור 3A), השתמשו בפוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE). קדח חורים צרים דרך ה- PTFE כדי להחדיר את האלקטרודות. המכשיר צריך להיות גבוה יותר מהתמיסה החוץ תאית, כך שהקצה העליון, שבו האלקטרודות חשופות, לעולם לא יבוא במגע עם התמיסה. לבידוד, השתמשו בדבק אפוקסי על כל חלק של מוליכי האלקטרודה שעלול להיחשף.
   2. השתמש בצורת פולס מרובע עם מחזור עבודה של 50%, ללא רכיב DC כדי למנוע אלקטרוליזה. יש לשנות את משך הדופק בין 10 μs ל-4 ms כדי לגרום לגירוי יעיל מבלי לשרוף את התרבית. ודא שהמשרעת היא בסדר גודל של ± 22 וולט (ראה איור 3). ניתן לצפות בפולס הריבועי על אוסצילוסקופ המחובר במקביל לאלקטרודות.
      הערה: לתכנות קל של כל צורת גל רצויה, השתמש בתוכנה מסחרית לעריכת צורת גל (ראה רשימת חומרים). הזן באופן גרפי את צורת הגל הרצויה ושלח אותה למחולל צורת הגל.
2. כדי לבדוק הומוגניות שדה, השתמש באלקטרודת בדיקה. השתמש ברשת של לפחות 1 מ"מ x 1 מ"מ כדי לאפשר לגשושית לנוע באזור שבין אלקטרודות ולמדוד פוטנציאל חשמלי.
   1. למדוד פוטנציאל חשמלי. השתמש כדי לחשב את השדה החשמלי. השתמש באחת האלקטרודות כאלקטרודת ייחוס. מדוד את השדה החשמלי עם משכי פולס משתנים בין 100 μs ל-4 ms (ראה איור 3B לדוגמה של משך פולס של 100 μs) כדי לוודא שהשדה הומוגני בטווח משכי הזמן המעוררים.
      הערה: ראו איור 3D לדוגמה של הומוגניות שדה חשמלי שנמדדה כאשר משך הדופק היה 1ms.

תוצאות

איור 1: עקבות לדוגמה של מעברי סידן שצולמו במהלך התפרצויות רשת סינכרוניות. A. תמונה של תאי עצב שנצבעו לפני הניסוי בצבע סידן. ב. עקבות של עוצמה לעומת זמן של החזר ההשקעה ב- A כאשר צבע העקבה מייצג את צבע הגבול של החזר ההשקעה ב- A. עלייה גדולה בעוצמה המסונכרנת בתוך שלושת ה-ROI מייצגת פרץ רשת[הוסף איור 2]

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סידן כלורי , 1M	פלוקה	21098	פתרון הקלטה חוץ-תאי.
D-(+)-גלוקוז, 1M	סיגמא-אולדריץ'	65146	ציפוי בינוני, פתרון הקלטה חוץ-תאי.
Hepes, 1M	סיגמא-אולדריץ'	H0887	פתרון הקלטה חוץ-תאי.
KCl, 3M	מרק	1049361000	פתרון הקלטה חוץ-תאי.
מגנזיום כלורי , 1M	סיגמא-אולדריץ'	M1028	פתרון הקלטה חוץ-תאי.
NaCl, 4M	ביו-מעבדה	19030591	פתרון הקלטה חוץ-תאי .
סוכרוז, 1M	סיגמא-אולדריץ'	S1888	פתרון הקלטה חוץ-תאי.
חוטי אלקטרודות	A-M Systems , קרלסבורג, וושינגטון	767000	גירוי חשמלי של תרבויות עצביות.
מחולל אותות	BKPrecision	4079	עיצוב האות החשמלי.
מגבר	תוצרת בית		הגברת מתח של האות ממחולל האותות לאלקטרודות.
ספק כוח	מטריצה	MPS-3005 LK-3	ספק כוח למכונת הגמגום.
חוטי פלטינה בעובי 0.005 אינץ'; A-M מערכות,	קרלסבורג, וושינגטון	767000	גירוי חשמלי של תרבויות עצביות.