גירוי של תרביות עצביות על ידי שדה מגנטי

תקציר

מקור: Stern, S., et al., <a href="https://app.jove.com/v/54357">עירור חיצוני של נוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים בתרבויות חד-ממדיות ודו-ממדיות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים שיטה לגירוי תרביות עצביות הגדלות בטבעת עגולה בדוגמת כיסוי באמצעות שדה מגנטי המשתנה בזמן.

פרוטוקול

1. הכנת כיסויים לתרביות 1D.

1. זכוכית נקייה מכסה על ידי טבילה בתמיסת פיראנה בסיסית המורכבת מ- 75 מ"ל DDW, 25 מ"ל 25% תמיסת אמוניה ו- 25 מ"ל 30% מי חמצן. הניחו את התמיסה עם כיסויי הזכוכית על צלחת חימום ב~ 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן יבשו את כיסויי הזכוכית בחנקן.
2. ראשית, החלקות הכיסוי מצופות בסרט כרום דק (99.999%) בעובי 6 Å, ואחריו שכבת זהב 30 Å (99.999%), באמצעות אדים או שקיעת מרזב.
   1. כדי להשיג קצב התזה של 0.05 – 1 Å לשנייה, השתמשו במכונת התזה עם 2 אלומות אלקטרוניות ובמערכת ואקום של 260 ליטר לשנייה עם גדלי יעד של 2 אינץ' ו-4 אינץ'. השתמש בשלב סיבוב שיכול לעבור מ- 0 ל- 100 סיבובים לדקה (סל"ד). השתמש בהספק זרם ישר (DC) של 0 עד 750 ואט.
   2. כדי לקבל פלזמה בלחץ של 10 mTorr בתא, סובב את המכשיר ב -30 סל"ד והשתמש בארגון ב 99.999%.
   3. הפעל את ספק הכוח של תותחי המקרטע בהספק מרזב DC של 40 W עבור הכרום, מה שמוביל ל~ 0.12 Å לשנייה קצב כיסוי, ובהספק התזה DC של 10 W עבור הזהב, מה שמוביל ל~ 0.28 Å/s.
3. באמצעות אולטרסאונד במשך 30 דקות, להמיס 0.1 גרם 1-octadecanethiol ב 100 mL ABS AR אתנול. יש להניח את החלקות הכיסוי מצופות Cr-Au בתמיסה זו למשך שעתיים, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול ABS AR ולייבש בחנקן.
4. הכינו תמיסה של 100 מ"ל מלח חוצץ פוספט של דולבקו (D-PBS) ו-3.5 גרם של קו-פולימר תלת-בלוקים (ראו טבלת חומרים/ריאגנטים) על ידי ערבוב במשך 1-2 שעות ב-600 - 700 סל"ד. מניחים את הכיסויים בתמיסה למשך שעה אחת. יבש מכסה עם חנקן.
5. חרטו באופן מכני את התבנית הרצויה על ידי גירוד שכבת הדחייה הביולוגית. עשו זאת באמצעות פלוטר עט, שבו העט מוחלף במחט תחריט. גרדו את הדוגמה דרך שכבות המתכת כדי להגיע לזכוכית שמתחתיה. שלוט בתהליך זה על ידי מחשב כדי להשיג תבנית רצויה משוכפלת. דפוסים שנוצרו על-ידי התהליך הזה מודגמים באיור 1 ובאיור 2.
6. הכינו שכבה תואמת ביולוגית של 100 מ"ל D-PBS, 3.5 גרם קו-פולימר תלת-בלוקים, פיברונקטין 35.7 מיקרוליטר/מ"ל ולמינין 29 מיקרוליטר/מ"ל.
   1. יש לעקר את החלקות הכיסוי באור אולטרה סגול למשך 10 דקות לפחות. לדגור על כיסויים בתמיסה המוכנה התואמת ביולוגית למשך הלילה.
      הערה: שכבת התאימות הביולוגית תיווצר רק במקום שבו שכבת הדחייה הביולוגית נחרטה בשלב הקודם.
   2. למחרת, שטפו את הכיסויים פעמיים עם P-DBS. לדגור אותם ב- PM למשך הלילה. הכיסויים מוכנים כעת לציפוי תאים.

2. תחזוקת התרביות העצביות.

1. הכינו מדיום משתנה (CM) המורכב (למ"ל): 0.9 מ"ל MEM+3G, 0.1 מ"ל HI HS, 10 μL 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) עם אורידין 100x.
2. הכן תווך סופי (FM) המורכב מ (למ"ל): 0.9 מ"ל MEM+3G ו- 0.1 מ"ל HI HS.
3. החלף PM עם 1-1.5 מ"ל CM לאחר 4 ימים במבחנה (DIV). ב 6 DIV, להחליף 50% של CM עם CM טרי. ב- DIV 8, שנה את המדיום ל- 1.5 מ"ל FM, ואחריו שינוי של 50% ב- FM כל יומיים. לאחר כשבוע מופיעה פעילות סינכרונית ספונטנית.

3. הדמיה של פעילות ספונטנית או מעוררת בתרביות עצביות עם צבעים פלואורסצנטיים.

1. הכינו תמיסה של 50 מיקרוגרם צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן (ראו טבלת חומרים/ריאגנטים) ב-50 מיקרוליטר DMSO (דימתיל סולפוקסיד).
2. הכינו תמיסת הקלטה חוץ-תאית (EM) המכילה (ב-mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-גלוקוז, 45 סוכרוז (pH 7.4).
3. לדגור על תרבית עצבית ב 2 מ"ל EM עם 8 μL של תמיסת צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן במשך 1 שעות. להגן מפני אור ולסובב בעדינות כדי להבטיח התפשטות הומוגנית של הצבע לתאים.
4. החלף את התמיסה בקרינה אלקטרומגנטית טרייה לפני ההדמיה. הדמיה פלואורסצנטית מודגמת באיור 3.
5. תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים אופטיים להדמיית סידן פלואורסצנטי (שיא עירור ב-488 ננומטר, שיא פליטה ב-520 ננומטר), באמצעות מצלמה ותוכנה המסוגלת לכמת את עוצמתו של כל אזור עניין (ROI) בשדה הראייה של המיקרוסקופ.

4. גירוי מגנטי של תרבויות

הערה: ההגדרה הבסיסית לגירוי מגנטי מוצגת באיור 1. בפינה הימנית העליונה מוצג מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המשמש להדמיה של צבעים רגישים לסידן בתאי העצב. הסליל המגנטי (עיגולים כחולים) ממוקם כ-5 מ"מ באופן קונצנטרי מעל תרבית טבעת עצבית (קו מתאר כחול). סליל איסוף (עיגול אדום) על היקף צלחת הפטרי מנטר את המתח המושרה על ידי הפולס המגנטי. בפינה השמאלית העליונה מוצגת הדינמיקה הנמדדת של סליל המגרה המגנטי (MS) עם עומס מתח קבל של 5,000 קילו-וולט, כפי שהוא משולב מסליל האיסוף. השדה החשמלי המושרה (מחושב עבור רדיוס טבעת של 14 מ"מ) מתואר בירוק ואילו השדה המגנטי מתואר בכחול. בתחתית מוצגות תמונות של התרבות העצבית. בפינה השמאלית התחתונה תמונת שדה בהיר של כיסוי בדוגמת 24 מ"מ. האזורים הלבנים הם תאי העצב. התבנית המצולמת מורכבת מתרביות טבעתיות קונצנטריות בעלות רדיוסים שונים. בפינה הימנית התחתונה יש זום על קטע קצר של הטבעות, המראה נוירונים בודדים. עבור קנה מידה, רוחב הטבעות הוא כ -200 מיקרומטר.

1. לגדל את הנוירונים בתבנית טבעת עגולה (חרוטה כמתואר ב 1.5) עבור גירוי תרבית 1D. השתמש בצבע פלואורסצנטי רגיש לסידן להדמיית סידן (כמתואר בסעיף 3) עם תרבית 1D בתבנית על קווים דקים (170 מיקרומטר), ארוכים (10 מ"מ).
   1. השתמשו בסליל מגנטי עגול ומקמו צלחת פטרי כ-5 מ"מ מתחת וקונצנטרית עם הסליל. השתמש בסליל מותאם אישית של סליל של כ- 30 מ"מ (קוטר פנימי, קוטר חיצוני של 46 מ"מ) עם השראות של L = 90 mH המונע על ידי MS תוצרת בית או מסחרי טעון במתח מרבי של 5 kV.
   2. כדי לעורר באופן מגנטי תרביות עצביות, מתח גבוה וזרם משתחררים דרך סליל מוליך באמצעות מתג מתח גבוה זרם. הממריץ המגנטי (MS) ניתן לבנות באמצעות קבלים גדולים, בסדר גודל של 100 mF, כדי לקבל מתח גבוה של 1 - 5 קילו וולט. לחלופין, השתמש בטרשת נפוצה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים/ריאגנטים).
      הערה: השתמש בחוט נחושת מלבני מלבני בעובי 0.254 מ"מ וברוחב 6.35 מ"מ מצופה פוליאסטר כדי לייצר סליל תוצרת בית. הפעל חוטים על מסגרות בהתאמה אישית, מבודדות בסיבי זכוכית, ויצק באפוקסי (ראה טבלת חומרים/ריאגנטים). לחלופין, השתמש בסלילים הזמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים/ריאגנטים).

תוצאות

איור 1: סכמה של המבנה המשמש לגירוי מגנטי של תרביות עצביות. A. בחלק העליון מוצג הסליל המגנטי (עיגולים כחולים), הממוקם 5 מ"מ קונצנטרית מעל תרבית הטבעת העצבית, ממוקם בצלחת פטרי (מתאר כחול). סליל איסוף (עיגול אדום) הממוקם על היקף צלחת הפטרי מודד את המתח המושרה על ידי הפולס המגנטי. בתחתית, הדינמיקה הנמדדת של סליל המגרה המגנטי מוצגת (באמצעות עומס מתח של קבל MS של 5,000 קילו-וולט), כפי שהיא משולבת מסליל הטנ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CaCl2 , 1M	פלוקה	21098	פתרון הקלטה חוץ-תאי
D-(+)-גלוקוז, 1M	סיגמא-אולדריץ'	65146	ציפוי בינוני, פתרון הקלטה חוץ-תאי
די-PBS	סיגמא-אולדריץ'	D8537	תרביות תאים
פיברונקטין	סיגמא-אולדריץ'	F1141	ציפוי ביולוגי
Fluo4, AM	טכנולוגיות חיים	F14201	הדמיה של פעילות ספונטנית או מעוררת
FUDR	סיגמא-אולדריץ'	F0503	שינוי מדיום
ג'נטמיצין	סיגמא-אולדריץ'	G1272	מדיום ציפוי, מדיום משתנה, מדיום סופי.
Hepes, 1M	סיגמא-אולדריץ'	H0887	פתרון הקלטה חוץ-תאי
היי HS	BI	04-124-1א	בינוני ציפוי, מדיום משתנה, מדיום סופי
KCl, 3M	מרק	1049361000	פתרון הקלטה חוץ-תאי
למינין	סיגמא-אולדריץ'	L2020	ציפוי ביולוגי.
MEM x 1	גיבקו	21090-022	בינוני ציפוי, מדיום משתנה, מדיום סופי
מגנזיום כלורי , 1M	סיגמא-אולדריץ'	M1028	פתרון הקלטה חוץ-תאי
NaCl, 4M	ביו-מעבדה	19030591	פתרון הקלטה חוץ-תאי
אוקטדקנתיול	סיגמא-אולדריץ'	1858	ניקוי כיסויים מצופים Cr-Au (תרביות 1D)
סוכרוז, 1M	סיגמא-אולדריץ'	S1888	פתרון הקלטה חוץ-תאי
אורידין	סיגמא-אולדריץ'	U3750	שינוי מדיום
מכונת התזה	AJA הבינלאומי, Inc	ATC Orion-5Series	ציפוי זכוכית בשכבות דקות של מתכת
פלוטר עט	היולט פקארד	HP 7475A	תחריט של דוגמה על הכיסוי המצופה
ספק כוח	מטריצה	MPS-3005 LK-3	ספק כוח למכונת הגמגום
אפוקסי	קוגניס	ורסמיד 140	יציקת סלילים תוצרת בית
אפוקסי	מעטפת	EPON 815	יציקת סלילים תוצרת בית