$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. אבלציה של תת-אוכלוסייה של תאי עצב באמצעות מיקרוסקופ לייזר דו-פוטוני
הערה: אם משתמשים מתכננים לבצע הדמיית Ca לאחר אבלציה, השתמש בקו UAShspzGCaMP6s. אם משתמשים מתכננים לבצע הקלטה התנהגותית לאחר אבלציה, השתמש בקו UAS:EGFP, מכיוון שקל יותר לבצע אבלציה של תאים חיוביים ל- EGFP מאשר של תאים המבטאים GCaMP6s.
- התחילו בהגדרת ההזדווגות של קו Gal4 המסמן תאי עצב ספציפיים שיש לחקור ו-UAS:EGFP או UAShspzGCaMP6s. הקפד להשתמש ברקע nacre עבור שני ההורים כך שניתן יהיה להשיג הומוזיגוטים nacre.
הערה: הומוזיגוטים של נאקר אינם מכילים מלנופורים על פני הגוף (איור 1B). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בקו Gal4 gSAIzGFFM119B (המסמן את הפרטקטום) וקו Gal4 נוסף hspGFFDMC76A (המסמן את ILH).
- ביום המחרת של מערך ההזדווגות, אספו את ביצי דגי הזברה, והעלו אותן לשלב הזחל, ואז הנוירונים המעניינים יביעו דיווחים פלואורסצנטיים.
- הרכיבו את זחל דג הזברה בנקודת התכה נמוכה של 2% (איור 1B).
- התחילו בהכנת תמיסת מלאי אגרוז 2%: המסו 2 גרם אבקת אגרוז בעלת נקודת התכה נמוכה במי מערכת של 100 מ"ל (כלומר, המים המשמשים לשמירה על דגי זברה בוגרים במערכת מים במחזור) או מי E3 על ידי חימום המים לנקודת הרתיחה במיקרוגל וערבוב נמרץ.
- חממו במיקרוגל את ציר האגרוז בעל נקודת ההתכה הנמוכה של 2% עד שהוא רותח. יוצקים 3.5-4.0 מ"ל של agarose על מכסה של צלחת פטרי 6 ס"מ. המתן עד שהאגרוז יתקרר כך שיהיה חם למגע לפני שתמשיך.
- לאחר מכן, מניחים זחל יחיד (לא מורדם בשלב זה) באגרוז. המשיכו לכוונן את המיקום והכיוון של הזחל כך שיהיה זקוף, באמצעות מחט חותכת (איור 1C), עד שהאגרוז יתמצק כדי להבטיח את המיקום הנכון של הזחל.
הערה: הזחל ימשיך לשחות בזמן שהאגרוז יתמצק.
- לאחר מיקום הזחל, המתינו 5 דקות עד שהאגרוז יתמצק לחלוטין.
- יוצקים 5 מ"ל של תמיסת טריקאין (0.4% בריכוז עבודה 1x) על agarose.
הערה: כדי למנוע תנועות של הזחלים במהלך אבלציה בלייזר, הזחלים חייבים להיות מורדמים לאורך כל הליך אבלציה.
- בטל את הזחל באמצעות פונקציית ההלבנה במערכת מיקרוסקופ לייזר של שני פוטונים.
- הניחו את הזחל המשובץ באגרוס תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני והפעילו את מערכת המיקרוסקופ.
- הפעל את התוכנה לרכישת תמונות ולחץ על כפתור "מופעל" בכרטיסייה "לייזר" כדי להפעיל את הלייזר (איור 1D). המתן עד שה"סטטוס" של הלייזר ישתנה מ"עסוק" ל"נעול מצב".
- בכרטיסייה "ערוצים", הגדר את אורך הגל של הלייזר ל- 880 ננומטר (הספק מרבי: כ- 2,300 mW) עבור אבלציה של EGFP, או על 800 ננומטר (הספק מרבי: כ- 2,600 mW) עבור אבלציה של GCaMP.
- בחר את עדשת המטרה 20X על ידי הזזת אקדח העדשה באופן ידני. לחץ על הכרטיסייה "איתור", לחץ על "GFP" כדי לשנות את המסלולים האופטיים, ולהציג ישירות את הפלואורסצנטיות בעין.
- אתר את מוח הזחל של דג הזברה במרכז הראייה; ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה "רכישה" כדי לחזור למיקרוסקופ של שני פוטונים.
- כתיעוד של מצב 'לפני אבלציה', צלם תמונה בערימת z עם עדשת 20X אובייקטיבית במהירות סריקה גבוהה (כדי למנוע נזקי חום). מאוחר יותר השוו את התמונות שצולמו לפני ואחרי ניסויי אבלציה (איור 2A). כדי להשיג z-stack, לחץ על "Z-Stack" כדי לבחור באפשרות z-stack ולהרחיב את הכרטיסייה. הגדר את הגבול התחתון (לחץ על כפתור "הגדר ראשון") לאחר התמקדות בקצה הגחוני של מוח הזחל, והגדר את הגבול העליון (לחץ על כפתור "הגדר אחרון") לאחר התמקדות במשטח הגבי ביותר של המוח. לאחר מכן, לחץ על כפתור "התחל ניסוי" כדי להפעיל את רכישת התמונה z-stack.
- בחר את עדשת האובייקט 63X על ידי הזזת אקדח העדשה באופן ידני.
- לחץ על הכרטיסייה "איתור" כדי לעבור למיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי, אתר את התאים שיש לאבלט במרכז העין בעין, ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה "רכישה" כדי לחזור למיקרוסקופ סריקת לייזר.
- בכרטיסייה "מצב רכישה", הגדר את "גודל מסגרת" ב 256 x 256. לחץ על "חי" והתבונן בנוירונים המעניינים.
- החל מהצד הגבי ביותר, למצוא מישור מוקד שבו התאים להיות ablated נמצאים ממוקדים.
- סמן אזור קטן ועגול בקוטר של כשליש מגודל התא על כל תא עצב כאזור עניין (ROI) באמצעות הפונקציה "אזורים".
- הגדר את מהירות הסריקה ל- 13.93 s/256 x 256 pixels (134.42 μm x 134.42 μm), המתאימה לזמן שהייה בלייזר של כ- 200 μs/pixel, או 200 μs/0.5 μm. כמו כן, הגדר 4 חזרות ('מחזור איטרציה: 4'). לחלופין, מטב את מספר האיטרציות ואת מהירות הסריקה, כך שתושג אבלציה מספקת.
- בצעו את פונקציית 'הלבנה' עבור אבלציה, בשילוב עם 'סדרת הזמן (2 מחזורים)' כדי לצלם את הדגימה (לפני ואחרי אבלציה) ו'אזורים' (כדי להגדיר את החזר ההשקעה) או פונקציות שוות ערך בתוכנה שבה נעשה שימוש (איור 1D).
- על-ידי השוואת התמונה הראשונה (לפני אבלציה) והתמונה השנייה (אחרי אבלציה) במחזור סדרת הזמן, ודא שלאחר הלבנה, הפלואורסצנטיות בתאי המטרה יורדת לזו שנצפתה ברמת הרקע (איור 2B).
- אם פלואורסצנטיות עדיין קיימת לאחר אבלציה, להגדיל את מספר חזרות.
- לאחר מכן, הזיזו את מישור המוקד מעט עמוק יותר (כלומר, לכיוון הצד הגחוני), ובחרו את מישור המוקד הבא שבו מופיעים תאים לא אבלטים.
- בצע את פונקציית ההלבנה כמתואר לעיל (שלב 1.9). חזור על שלבים אלה עד שכל התאים במבנה העצבי של העניין כבר ablated.
- לאחר שעבר את כל מישורי המוקד המכסים את המבנים העצביים להיות ablated, לבדוק את התאים עבור פלואורסצנטיות מבוטלת. אם נמצא שחלק מהתאים עדיין פלואורסצנטיים עקב אבלציה לא מספקת, יש להקרין אותם שוב בלייזר כמתואר לעיל.
- אם הזחל זקוק להתאוששות מהאגרוז לאחר הקרנת לייזר, אל תנסה להוציא אותו בכוח מהאגרוז מכיוון שהדבר עלול לפגוע בזחל. במקום זאת, בצעו בזהירות חתכים זעירים באגרוז סביב הזחל בניצב לפני השטח של גופו. לאחר מכן, חכו שהזחל ישחה החוצה מהאגרוז בכוחות עצמו כאשר חומר ההרדמה יפוג.
- המשך לזחל הבא לאבלציה או בצע ניסויי בקרה באמצעות אוכלוסייה אחרת של נוירונים שאינם מעורבים בהתנהגות הנחקרת.
הערה: כאן, כבקרה, נוירונים פקעת ריח ב UAS:EGFP; זחלי gSAIzGFFM119B עברו אבלציה בלייזר באמצעות אותו פרוטוקול שתואר לעיל (איור 2A, מימין).
- המתן מספר שעות או יום אחד להתאוששות לפני שתמשיך להדמיית Ca (סעיף 2) או רישום התנהגותי (סעיף 3). במהלך זמן התאוששות זה, בדוק את בריאות הזחל (כלומר, שחייה ספונטנית רגילה, ללא נזקי חום נראים לעין סביב האזור ablated, וכו ') ולהסיר זחלים המראים סימנים של בריאות לקויה.
2. הדמיית סידן לתיעוד פעילות עצבית המעוררת טרף בזחלי דגי זברה טרום-טקטום
- כדי להכין תא הקלטה, הניחו אטם תא הכלאה עם אטימה מאובטחת על מגלשת זכוכית, כשצד הדבק פונה אל הזכוכית, והסירו את האטם העליון.
הערה: כך נוצר תא הקלטה קטן בקוטר 9 מ"מ ובעומק 0.8 מ"מ (איור 3A).
- לאחר מכן, מניחים רשת ניילון (גודל הפתיחה: 32 מיקרומטר) על צינור 50 מ"ל שהחלק התחתון שלו פתוח. השתמשו במכסה כדי לחבר את הרשת על הצינור (איור 3B).
- הכינו את הפרמציה (שהיא הטרף שישמש כגירוי חזותי לזחל).
הערה: הכינו את תרבית הפרמציום (שלבים 2.3.1 ו-2.3.2) מראש.
- להשיג תרבית זרעי פרמציה ממקורות מסחריים או ממרכזי משאבים ביולוגיים אקדמיים מראש.
- תרבו את הפרמציום במשך כמה ימים במים שהכילו קש אורז אוטוקלאבי וגלולה של שמרי בירה יבשים (איור 3C).
- יוצקים את תרבית הפרמציום דרך 2 מסננות ברצף (אחת עם צמצם של 150 מיקרומטר, ואחריה אחרת עם צמצם של 75 מיקרומטר) כדי להסיר פסולת מהתרבית.
- לאסוף paramecia בזרימה מן השלב הקודם על רשת ניילון (צמצם 13 מיקרומטר).
- תלו מחדש את הפרמציה על רשת הניילון לתוך זכוכית באמצעות בקבוק סחיטה של מי מערכת (איור 3D).
- שטפו את הרשת (איור 3B) במי מערכת 2x (איור 3E).
הערה: מטרת צעד זה היא להסיר את כל הריחות והטעמים האפשריים הכלולים במדיום תרבית הפרמציום, שכן מטרת המחקר הנוכחי היא לצפות בפעילות עצבית מונעת חזותית.
- מניחים זחל דג זברה בתמיסת הטריקאין להרדים.
- הרכיבו זחל בודד באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 2%.
- ראשית, יש לחמם במיקרוגל אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 2% ולהוסיף לאגרוז נפח של 1/10 טריקאין מרוכז פי 10.
- הניחו טיפה אחת של האגרוז המכיל טריקאין על תא ההקלטה (איור 3A).
- לאחר אישור שהאגרוז אינו חם מדי, הניחו את הזחל המורדם (משלב 2.5) לתוך האגרוז, והסירו מיד כל אגרוז עודף, כך שפני השטח של האגרוז ייראו קמורים מעט.
- כוונו במהירות את הזחל למצב זקוף בעזרת מחט לניתוח (איור 1C).
הערה: הליכים אלה חייבים להסתיים תוך מספר שניות לפני שהאגרוז מתמצק.
- ברגע שהזחל ממוקם כראוי, המתן 5 דקות לאגרוז להתמצק לחלוטין. לאחר מכן, יוצקים טיפה של תמיסת טריקאין 1x על האגרוז.
- הסר את האגרוז סביב ראשו של זחל הזברה ופנה מקום לפרמציום לשחות באמצעות סכין כירורגית. כדי לעשות זאת, ראשית, בצעו כמה חתכים קטנים באגרוז (איור 3F). לאחר מכן, בזהירות להסיר את האגרוז עודף על ידי בעדינות לשפוך מים המערכת על החדר.
הערה: בשלב זה, הטריקאין יישטף.
- לאחר מכן, שים פרמציום אחד בתא ההקלטה כדי לשמש גירוי חזותי.
הערה: כאשר הפרמציום שוחה ליד ראשו של זחל דג הזברה, הוא יעורר תגובה עצבית (איור 3G).
- מקמו את תא ההקלטה תחת מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי המצויד במצלמת CMOS מדעית (איור 3H) ובחרו עדשה אובייקטיבית פי 2.5 (איור 3I).
- אסוף הקלטות בהילוך מהיר של אותות הפלואורסצנטיות של GCaMP.
- הפעל את יישום רכישת התמונה עבור המצלמה המאובזרת.
- לחץ על "רצף חלונית" ובחר "רשומת דיסק קשיח" בחלונית. בקטע הגדרות סריקה, הגדר את "ספירת מסגרות" ל- 900 או כל מספר מסגרת כולל אחר הרצוי.
הערה: אם זמין, השתמש בתוכנת הקלטה בהילוך מהיר עם מודול (כאן, "רשומת דיסק קשיח") המאפשרת שמירה יעילה של הנתונים בכונן הקשיח.
- בחלונית "לכידה", הגדר את זמן החשיפה ל- 30 אלפיות השנייה (כלומר, 33.3 פריימים לשנייה) ולבינינג 2 x 2.
- בלוח המגע השולט במיקרוסקופ, בחר ערכת מסננים עבור GFP, מכיוון של- GCaMP יש ספקטרום עירור/פליטה דומה ל- GFP.
- לחץ על "Live" בחלונית Capture כדי לאתר את הזחל בתצוגת המצלמה ובמיקוד (איור 4A), ולאחר מכן לחץ על "Stop Live" ולחץ על הלחצן "Start". שמור את הסרט ב- .cxd או בכל תבנית אחרת המכילה מידע אודות תנאי הרכישה.
