$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. אלקטרופיזיולוגיה
הערה: מטרת פרוטוקול זה היא להשיג רישומי מהדק זרם של תאים שלמים מתאי עצב פירמידליים בשכבה II/III המזוהים חזותית על ידי ביטוי GFP במוחות עכברים מחודדי GFP (או כל חלבון פלואורסצנטי אחר שהתחשמל בעבר). באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לחקור את ההשפעה של שינוי גנטי שהונהג על ידי IUE על התכונות החשמליות של הנוירון. רכישת מצבי ירי ספציפיים היא תהליך הדרגתי של בידול הכולל ביטוי דינמי של רפרטואר רחב של תעלות יונים ומביא לביטוי מצבי ירי ארעיים לפני שלבים מאוחרים לאחר הלידה. לדוגמה, תגובות חשמליות בוגרות אינן נצפות בשכבות II/III של קליפת המוח של העכבר הסומטוסנסורי לפני P16.
- תנאים מוקדמים לפרוסות החריפות
- הכן 1 ליטר של ACSF באמצעות טוהר גבוה (מים מזוקקים כפולים) המכילים 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM גלוקוז, 2.5 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, ו 1 mM NaH2PO4. טיטראט את ה- pH ל 7.3 - 7.4 עם HCl או NaOH. התאם את האוסמולריות ל- 290 mOsm.
- בועות ACSF עם קרבוגן (95% O2/5% CO2) במשך 15 - 20 דקות באמצעות צינורות טפלון (~ 1 מ"מ), כדי לייצב את ה- pH ל 7.3 - 7.4.
- תנאים מוקדמים להקלטת התא כולו
- ודאו שתחנת האלקטרופיזיולוגיה מצוידת בתא הקלטה, מערכת זילוח, מיקרוסקופ, אלקטרודות (הקלטה, גירוי וקרקע), מאקרו ומיקרומניפולטורים, משטח שולחן קשיח עמיד בפני רעידות וכלוב פאראדיי, מגרה, מגבר וממיר אנלוגי-לדיגיטלי (A/D), מחשב עם תוכנת רכישה, ומסנן GFP (או כל פלואורוכרום אחר) לניתוח תאי עצב מהונדסים גנטית (איור 1A).
- הכינו את התמיסה התוך-תאית, המכילה 115 mM אשלגן גלוקונאט, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mM Na2ATP ו-0.3 mM Na3GTP, מותאמת ל-pH 7.2 על ידי KOH ול-290 mOsm על ידי KCl.
- הכינו פיפטות טלאי על ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט. הכינו אלקטרודות טלאי באמצעות מושך מיקרופיפטה. השתמש נימי בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, קוטר פנימי 0.86 מ"מ, אורך 10 ס"מ). צור אלקטרודות טלאי המראות התנגדות של 3-10 MΩ כאשר הן מלאות בתמיסה תוך-תאית.
- יש לנקב את תא ההקלטה עם ACSF בקצב של 2 מ"ל/דקה. לשמור על טמפרטורת התא על כ-33°C.
- הקלטה של תא שלם
- מעבירים את הפרוסות לתא ההקלטה בעזרת פיפטת פסטר (חותכים את הקצה הארוך) או בעזרת מברשת קטנה. החזיקו את הפרוסה עם נבל. מחוררים את הפרוסות כל הזמן עם ACSF בקצב של 2 מ"ל/דקה.
- תיקון נוירון חיובי GFP.
- הכניסו את הפרוסה לתא ההקלטה ומצאו את אזור העניין דרך המיקרוסקופ בהגדלה נמוכה (פי 10). לאחר מכן, מצא תא חיובי לתיקון GFP באמצעות המטרה 60x.
- מלא את אלקטרודת ההקלטה בתמיסה תוך תאית. השתמש במזרק המקושר למסנן (מסנן 4 מ"מ) ובקצה המיקרו-מטעין כדי למלא את אלקטרודת ההקלטה בתמיסה תוך תאית.
- מניחים את פיפטת הזכוכית במחזיק הפיפטה. הניחו את קצה הפיפטה באמבטיה והתמקדו בקצה. ברגע שהפיפטה נמצאת באמבטיה, הפעילו לחץ חיובי דרך מערכת בקרת לחץ הגב.
- תקנו תא עצב שהוא פלואורסצנטי (איור 1B).
- התקרבו לתא המעניין תחת הנחיה חזותית תוך שמירה על לחץ אחורי בפיפטה. עם הופעתה של גומה קטנה על פני התא, לשחרר את הלחץ. בשלב זה, אטימה הדוקה (התנגדות גדולה מ 1 GΩ) עשוי להיווצר. אחרת, להחיל לחץ שלילי קל (יניקה) כדי להקל על זה.
- בזמן יצירת האטם, הביאו את מהדק מתח האחיזה ל -60 mV. ברגע שחותם GΩ נוצר, יש להפעיל פולס של יניקה כדי לקרוע את קרום התא מתחת לפיפטה ולעבור למצב של תא שלם.
- הקלט את הפעילות באמצעות תנאי מהדק זרם. לאחר שנמצא במצב תא שלם, עבור ממצב מהדק מתח למצב מהדק זרם והתחל להקליט. לדוגמה, כדי לתעד את ההתרגשות של התא, החל זריקות זרם דה-פולריזציה באורך 500 אלפיות השנייה (100 - 400 pA).
- חשב את קצבי הירי על ידי התוויית מספר פוטנציאלי הפעולה לאורך הרכבת להגדלת זרמי הקלט.
הערה: ניתן גם לחשב את פוטנציאל הממברנה במנוחה, התנגדות הקלט וקיבול הממברנה מההקלטות.
