מדידת רמות גלוטמט במוח בהרדמה בחזירונים יילודים באמצעות מערך מיקרואלקטרודות

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. טיפול בחזרזירים ובחזרזירים

1. השתמש בזכרונים זכרים ונקבות באופן שיטתי ואקראי כדי לחסל כל בלבול פוטנציאלי מבוסס מין בהתאם להנחיות ARRIVE .
   הערה: מכיוון שתקופת גדילת המוח המקסימלית היא בתוך 3-5 ימים מלידת חזרזיר, הניסויים נעשים אך ורק עם חזירונים בני 3-5 ימים.
2. יש לוודא שהחזרזירים מגיעים לוויבריום לפחות 24 שעות לפני הניסוי כדי לאפשר התאקלמות לסביבה.
   הערה: צוות וטרינרי מיומן מספק טיפול שגרתי בבעלי חיים. החזרזירים מוחזקים בכלובים נפרדים המתוחזקים בטמפרטורה, מנוטרים ברציפות ומקבלים תחליף חלב מלא מבחינה תזונתית למניעת היפוגליקמיה. החזרזירים נשמרים גם ללא תחליף חלב (אפס לכל מערכת הפעלה), לפחות 3 שעות לפני ההרדמה ומסופקים עם שמיכות וצעצועים כדי להבטיח רמות נורמליות של גירוי. במידת האפשר, החזיקו מספר חזרזירים באותו כלוב כדי לאפשר סוציאליזציה.

2. פיתוח והתאמה אישית של מערכי מיקרואלקטרודות (MEAs) עבור רעילות עצבית הנגרמת על ידי הרדמה (AIN) מחקרים במודל חזרזיר

הערה: טכנולוגיה זו משתמשת ב-MEAs מבוססי אנזימים המצופים מראש באנזים ומצופים ב-m-phenylenediamine dihydrochloride (mPD). האלקטרודות תוכננו בהתאמה אישית עם מוט קשיח בקוטר 40 מ"מ ויוצרו לשימוש בחזירונים (איור 1).

1. אנא ראו תיאור מפורט של הכנה וכיול MEA (איור 2).

3. הרדמה ושימוש במנגנון סטריאוטקסי מותאם אישית עבור חזרזיר

1. להרדים בעלי חיים באמצעות תחנת הרדמה עם מכשיר הנשמה וניטור מתאימים, ולנטר פרמטרים פיזיולוגיים כגון אוקסימטריה של הדופק, לחץ דם לא פולשני, אלקטרוקרדיוגרפיה וטמפרטורה לאורך כל הניסוי כפי שתואר קודם לכן. יש לבצע אינטובציה ולאוורר את החזרזירים ולבצע הרדמה סבופלורנית בריכוז מכתשי מינימלי (MAC) (כ-2.5-3%) למשך 3.5 שעות. ודא כי אנשי צוות מעבדה מיומנים נוכחים בניסויים אלה. פרווה מעל אזור הניתוח מוסרת באמצעות קוצץ חשמלי לפני הכנת העור.
   הערה: ריכוז ומשך ההרדמה בהם נעשה שימוש מאפשרים לניסוי לדמות את משך הזמן של חשיפה להרדמה בפועל במהלך הליך כירורגי. בנוסף, סבופלורן הוא חומר ההרדמה הכללי הנפוץ ביותר באוכלוסיית הילדים, ולכן החקירה סביב בטיחותו היא בעלת חשיבות עליונה.
2. לפני הכניסה למסגרת הסטריאוטקסית, יש להתחיל במינון העמסת רוקורוניום של 2.5 מ"ג/ק"ג ועירוי של 1.5 מ"ג/ק"ג/שעה למניעת תנועת בעלי חיים בזמן שהם מאובטחים בתוך המסגרת.
   1. הניחו את החזרזיר במסגרת סטריאוטקסית ספציפית לאזיר ברגע שעומק הרדמה מספיק אושר על ידי צביטת בוהן.
   2. ספק ריפוד הולם בתוך המסגרת הסטריאוטקסית על ידי הנחת החזרזיר על כרית חימום אוויר מאולצת עם ריפוד נוסף (למשל, מיקום נוזלי) כדי למנוע כיבי לחץ.
   3. הניחו את שיני הלסת העליונה מעל מוט השן (איור 3).
      הערה: מוט השן צריך להיות ברמה מספקת כדי להחזיק את הגולגולת בחוזקה במקומה.
   4. תקן והדק את מוטות האוזניים החודרים בתוך האוזניים, תוך הקפדה על כך שהחזרזיר נמצא במצב קו האמצע. מקמו את הקצוות המחודדים של האחיזה הצידית בתוך תעלת האוזן והכניסו את מוטות האוזניים מספיק חזק כדי לשמוע את צליל ה"פופ" הקשור לחדירה של קרום הטימפאן. חברו היטב את מוטות האוזניים לגולגולת והכניסו לעומק שווה בכל צד כדי למנוע תזוזה של הגולגולת במהלך הניסוי (איור 4, לוח A).
      הערה: חשוב ביותר לשמור על חום חזרזיר (~ 37.8-38.6 מעלות צלזיוס) ולפקח ברציפות על הטמפרטורה במהלך כל ההליך לשמירה על נורמותרמיה. ניתן לעשות זאת באמצעות שמיכה ו/או מנורת חום. הקפד למקם את מנורת החום במרחק מתאים כדי למנוע צריבה של העור של החיה.
3. צור חתך קו אמצע של 4-6 ס"מ לאורך הגולגולת בזהירות כדי למנוע ניקוד הגולגולת עם האזמל. לאחר ביצוע החתך, השתמש בנסיגה עדינה ובדיסקציה קהה כדי להרים את הקרקפת מהגולגולת. שפשפו בעדינות את הגולגולת עם פד גזה כדי להסיר כל רקמת חיבור ולחשוף את קווי התפרים (איור 4, לוח B).
   הערה: אין צורך לשמור על סטריליות במהלך ניסויים שאינם הישרדותיים. עם זאת, יש לשמור על סטריליות במהלך ניסויי הישרדות.
4. שיקוף נוסף של הקרקפת, במידת הצורך, כדי לחשוף את האזור המעניין ולקבוע את המיקום המיועד לקרניוטומיה (איור 5, לוח A). השתמשו במקדחה כירורגית כדי ליצור חלון קרניוטומיה של כ-0.25 ס"מ² (עשוי להיות גדול או קטן יותר, תלוי במטרות הניסוי) מעל מבנה העניין, תוך זהירות שלא לפגוע בדורה או במוח שמתחתיה (איור 5, לוח B). השתמשו במספריים כירורגיים עדינים כדי לכרות את הדורה שמעל רקמת המוח (איור 5, לוח C).
5. מקם את האלקטרודה אנכית ככל האפשר מעל הברגמה על ידי אבטחת זרוע המתכת של הבמה למיקרומניפולטור של סטריאוטקס החזרזיר. הנמיכו את האלקטרודה ככל האפשר מבלי לגעת בפני השטח של הגולגולת. רשמו את הקואורדינטות של הברגמה (איור 6, לוח A).
   1. לקבוע את הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות והמדיאליות-צדדיות, כמו גם את עומק מבנה העניין כפי שהן מתייחסות לברגמה. קבע את הקואורדינטות הסטריאוטקסיות באמצעות מין ואטלס סטריאוטקסי המתאים לגיל. במקרה זה, השתמש באטלס סטריאוטקסי שפותח במיוחד עבור חזרזירים.
   2. מקם מחדש את האלקטרודה כך שתהיה לה את המיקום הקדמי-אחורי והמדיאלי-לטרלי הנכון, וודא שגם המיקרואלקטרודה וגם המנגנון נמצאים בניצב לפני השטח. הניחו את אלקטרודת הייחוס המדומה מתחת לקרקפת, כדי להבטיח מגע עם החיה (איור 6, לוח B).
   3. לאט ובעדינות, הורידו את האלקטרודה לעומק המתאים לתוך המוח באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית. עבור 2 המ"מ האחרונים, השתמש במיקרו-כונן הידראולי כדי להמשיך ולהניע את האלקטרודה למיקום המדויק (איור 6, לוח C).
      הערה: מיקום האלקטרודה צריך לכסות את חלון הקרניוטומיה. עומק האלקטרודה ישתנה בהתאם למבנה המוח המעניין. אין צורך לסגור את החתך עם השלמת איסוף הנתונים בניסויים שאינם הישרדותיים.

4. מדידת גלוטמט חוץ-תאי בהרדמה סבופלורנית

1. ודא שהחזרזיר נמצא תחת ניטור פיזיולוגי רציף לאורך כל ההליך. החזרזירים מורדמים בשאיפה (באמצעות קונוס פנים) כהכנה להליך.
2. לאחר השתלת MEA, המתינו 30 דקות כדי לאפשר לאלקטרודה להגיע לקו הבסיס כדי להבטיח שתתקבל מדידה נכונה במשך 3 שעות (איור 7).
3. 0.25% bupivacaine (1 מ"ל / ק"ג) מנוהל תת עורית במקום הניתוח לטיפול בכאב לאחר הניתוח. בנוסף, buprenorphine בשחרור מושהה ניתן q72h תת עורית לפי הצורך.

איור 1: השוואה חזותית של סוגי מערכי מיקרואלקטרודות SG-2. מערכי SG-2 מכילים שני אתרים רגישים לגלוטמט ושני אתרי זקיף רגישים לגלוטמט (150 מיקרומטר x 20 מיקרומטר לאתר). (A) מערך מיקרואלקטרודות בעל פיר גמיש מוצג משמאל. מערך המיקרואלקטרודות בעל המוט הקשיח תוכנן במיוחד לשימוש בחזירונים ומאפשר השתלה עמוקה יותר בבעלי חיים גדולים.

איור 2: סקירה כללית של תהליך ההכנה והכיול של מערך מיקרואלקטרודות. ההכנה והכיול הכוללים של MEA נמשכים כשבוע. אנזים הציפוי, שכבת ההרחקה ואנליטות הכיול הם ספציפיים למוליך העצבי המעניין.

איור 3: מיקום חזרזיר במנגנון הסטריאוטקסי. פה החזרזיר מונח על מוט הפה ישירות אחורית לשיני הכלב. מוטות האוזן החודרים מוחדרים לתעלות האוזן כדי לאבטח את הקצה האחורי של הגולגולת.

איור 4: מיקום חזרזיר במנגנון הסטריאוטקסי לקרניוטומיה. (A) ראש החזרזיר מאובטח היטב בתוך המסגרת הסטריאוטקסית המותאמת אישית, מה שמבטיח מיקום עקבי של MEA. ניתן לראות מיקום שווה של מוטות אוזניים חודרים. (B) חתך קדמי-אחורי בקו האמצע לאורך הקרקפת. ניקוד הגולגולת נמנע כדי לדמיין תפרים קורונליים ו sagittal לייעל הדמיה של bregma. סרגל קנה המידה מוצג כדי לציין את הגודל היחסי של החתך ואת המיקום של חלון craniotomy.

איור 5: קרניוטומיה לגישה להיפוקמפוס. (A) הקרקפת המשתקפת עוד יותר כדי לחשוף את המיקום המשוער של החדרת MEA על פי קואורדינטות סטריאוטקסיות. האזור המעוגל מסומן (נקודה שחורה) כדי להנחות את הקרניוטומיה. (B) חלון קרניוטומיה (0.25 סמ"ר) עם דש גולגולת שהוסר כדי לחשוף את הדורה מאטר שמתחתיו. (C) קרומי המוח הוסרו בזהירות כדי לחשוף קליפת מוח שטחית ללא טראומה לרקמות.

איור 6: מיקום MEA והחדרתו להיפוקמפוס. (A) מיקום MEA בברגמה כדי לקבוע מיקום סטריאוטקסי יחסי של ההיפוקמפוס. (B) מיקום סטריאוטקסי של MEA על פני השטח של המוח כדי לקבוע את עומק החדרת ההיפוקמפוס. אלקטרודת פסאודו-ייחוס כסופה הממוקמת היטב מתחת לקרקפת (מסומנת בחץ). (C) MEA המוחדר בעומק המתאים כדי לקבל מדידות גלוטמט חוץ-תאיות in vivo בזמן אמת בהיפוקמפוס.

איור 7: התנהגות MEA במהלך תקופת הבסיס של 30 דקות. העלייה המהירה הראשונית תואמת את הירידה של MEA לתוך ההיפוקמפוס באמצעות מיקרומניפולטור. תקופת הבסיס מתחילה ברגע שה-MEA הגיע לעומק המתאים (קו מקווקו). מדידות גלוטמט חוץ-תאיות יפחתו במשך 30 דקות ואין לפרש אותן כקריאות פיזיולוגיות.