רישום פעילות עצבית של רקמת היפוקמפוס פרושה באמצעות מערך מיקרואלקטרודות חודרות

תקציר

מקור: Zhang, M., et al. התפשטות פעילות עצבית בתכשיר היפוקמפוס פתוח עם מערך מיקרו-אלקטרודות חודר. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את ההליך להקמת תא הקלטה עם מערך מיקרואלקטרודות חודר (PMEA) כדי ללכוד אותות עצביים מהיפוקמפוס פתוח. שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את המהירות והכיוון של התפשטות הפעילות העצבית בתוך ההיפוקמפוס הפרוש במבחנה.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הסקירה האתית המתאימה של בעלי חיים.

1. פתרונות לניתוח ורישום ניסיוני

1. הכינו מאגר נוזל מוחי מלאכותי רגיל (aCSF) המכיל (mM) NaCl (נתרן כלורי) 124, KCl (אשלגן כלורי) 3.75, KH₂PO₄ (אשלגן דימימן פוספט) 1.25, MgSO₄ (מגנזיום גופרתי) 2, NaHCO₃ (סודיום ביקרבונט) 26, דקסטרוז 10 ו-CaCl₂ (סידן כלורי) 2. השתמש ב- aCSF רגיל זה לשחזור רקמות לאחר דיסקציה ולמערכת הכביסה בתחילת הניסוי.
2. הכינו סוכרוז aCSF המשמש במהלך דיסקציה של ההיפוקמפוס ומכיל (mM): סוכרוז 220, KCl 2.95, NaH₂PO₄ (נתרן דימימן פוספט) 1.3, MgSO₄ 2, NaHCO₃ 26, דקסטרוז 10 ו-CaCl₂ 2. על מנת לגרום לפעילות אפילפטיפורמית בהכנת רקמת ההיפוקמפוס התקינה, יש להוסיף 4-Aminopyridine (4-AP) ל-aCSF תקין בריכוז של 100 מיקרומטר.

2. הצבת ההיפוקמפוס הפרוש על מערך המיקרואלקטרודות החודר (PMEA) כדי לרשום את הפעילות העצבית

1. כדי להכין את מערך הניסוי, מלא בקבוק אחד עם aCSF רגיל ובקבוק אחר עם 4-AP aCSF. בשני הבקבוקים, מבעבעים 95% O₂ / 5% CO₂ כבר מתחילת כל ניסוי. השתמש במחבר בעל שלושה שסתומים כדי לשלוט בפתרון שייבחר במהלך ניסוי. חבר צינור ואקום במוצא התא כדי לשאוב את התמיסה לתוך מיכל אבק. חממו את הצינור לפני העברתו לתא ההקלטה ושמרו על התמיסה ברמת טמפרטורה מבוקרת (35°C).
2. כאשר הכניסה והשקע של תא ההקלטה סגורים, השתמש בטפטפת פיפטה מזכוכית בהתאמה אישית כדי להעביר ולמקם את ההיפוקמפוס הפתוח לתוך התא. מתחת למיקרוסקופ, מקמו את ההיפוקמפוס הפתוח באמצעות מברשת צבע קטנה רגילה בזמן שהרקמה צפה בתמיסה. הניחו את ההיפוקמפוס הפרוש כשצד הנאדיות שלו פונה כלפי מטה, אזור CA3 מצביע הצידה ושדה CA1 מצביע לכיוון החוקר.
3. יש למצוץ בזהירות את התמיסה בתא באמצעות פיפטת ואקום מקצה תא ההקלטה כדי להוריד את רמת התמיסה עד לייבוש התא והורדת הרקמה למערך. לאחר מכן, הניחו בזהירות עוגן רקמה מותאם אישית (איור 1) (מס' 7 בחומרים וציוד ספציפיים) על גבי הרקמה כדי להחזיק את ההיפוקמפוס הפתוח על המערך. הכניסו כמה טיפות תמיסה לתא ההקלטה כדי למלא אותו מחדש, ופתחו בהדרגה את הכניסה והשקע כדי להתאים את קצב הזרימה לכשתי טיפות לשנייה בתא הטפטוף בעירוי.
4. דגרו על הרקמה בתא ההקלטה עם aCSF רגיל למשך כדקה אחת כדי להתאושש, ואז העבירו את אספקת התמיסה ל-aCSF מומס 4-AP והתאימו את קצב הזרימה כראוי. לדגור על הרקמה ב- aCSF מומס 4-AP במשך כ 5 עד 10 דקות, ואז החוקר יכול להפעיל את התוכנה כדי להקליט את האות כאשר פעילות ספונטנית מופיעה.

תוצאות

איור 1. מערך ניסיוני. (A) מכסה כיסוי פלסטיק עם ברגים מונח מעל המעגלים כדי להגן עליו מפני נזקי מים אפשריים. לתא ההקלטה יש צינורות כניסה ויציאה כדי לשאת את זרימת התמיסה. עוגן רקמה בהתאמה אישית המודבק ברשת סיבי ניילון משמש לאבטחת הרקמה במהלך הניסויים. (B) תמונה שצולמה מתחתית מצע הזכוכית של PMEA המראה את עוגן הרקמה מחזיק פרוסת דגימה במהלך ניסוי. החוטים המעוקלים הם סיבי הניילון מהרשת הלו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מברשת צבע קטנה	לואו'ס	tem #: 105657 דגם #: 90219	זו עם הגודל הקטן ביותר באריזת מברשת צבע רגילה
כלי עזרה מזכוכית מלוטשת אש	לא ישים	לא ישים	כלי זה לוטש באש ועשוי מפיפטות זכוכית פסטר רגילות.
מחט זכוכית בהתאמה אישית	לא ישים	לא ישים	כלי זה לוטש באש ועשוי מפיפטות זכוכית פסטר רגילות.
כלי זכוכית בהתאמה אישית עם לולאת חוט מתכת	לא ישים	לא ישים	כלי זה לוטש באש ועשוי מפיפטות זכוכית פסטר רגילות עם לולאת תיל מתכת שעוצבה מחדש.
טפטפת תמיסת זכוכית בהתאמה אישית	לא ישים	לא ישים	כלי זה היה עשוי פיפטות זכוכית פסטר רגיל עם קצותיו לחתוך ראש גומי מחובר עם קצה לחתוך.
עוגן רקמות בהתאמה אישית	לא ישים	לא ישים	רשת סיבי ניילון הודבקה על טבעת חוט נחושת מבודדת. עוגן הרקמה הוחזק על ידי מיקרומניפולטור.
מערך מיקרואלקטרודות מפוברק בהתאמה אישית	לא ישים	לא ישים	פרטים נוספים על המערך אנא עיין Kibler, et al, 2011.
מעגלי סינון ומגברים בהתאמה אישית עבור המערך	לא ישים	לא ישים	פרטים נוספים על המערך אנא עיין Kibler, et al, 2011.
מעבד רכישת נתונים 3400a	מעבדות מיקרוסטאר	לא ישים	זוהי מערכת איסוף נתונים מלאה עם ממיר A/D.