הכנת מודל חולדה להערכת תקינות מסלול הראייה באמצעות מערך אלקטרופיזיולוגי

תקציר

מקור: Nguyen, C. T. et al., הקלטה סימולטנית של אלקטרורטינוגרפיה ופוטנציאלים מעוררים חזותיים בחולדות מורדמות.J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הכנת מודל חולדות לחקר בריאות הרשתית ותקינות מסלול הראייה. פוטנציאל מעורר חזותי וייחוס אלקטרורטינוגרפי ואלקטרודות פעילות מחוברים לחולדה, ולאחר מכן יישור הפלטפורמה עם החולדה מול קערת גנצפלד להארה רשתית אחידה וסגירת כלוב פאראדיי כדי למנוע הפרעות חיצוניות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. טרום השתלה של אלקטרודות בעלות פוטנציאל חזותי כרוני (VEP)

הערה: אם יש לאסוף אותות אלקטרורטינוגרמה (ERG) ו-VEP בו-זמניים, בעלי חיים חייבים להיות מושתלים בניתוח עם אלקטרודות VEP לפחות שבוע לפני איסוף האותות.

1. יש לעקר את ספסל הניתוחים לפני הניסוי על ידי ניקוי עם כלורהקסידין (0.5% באתנול 70%). Autoclave כל ציוד כירורגי לפני השימוש. כסו את החיה בשטיפה כירורגית מעוקרת. ודא שכל הנסיינים לובשים מסכות כירורגיות, חלוקים וכפפות מעוקרות.
2. יש להשרות הרדמה עם 3-3.5% איזופלורן עם O₂ בקצב זרימה של 3 ליטר/דקה. לשמור על הרדמה של 1.5% ו-2 ליטר/דקה לאורך כל הניתוח. להבטיח עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטת כפות.
3. החל 1% carboxymethylcellulose נתרן על הקרנית כדי למנוע התייבשות של העיניים.
4. יש לגלח שטח בגודל 30X30 מ"מ מעל המצח, אחורי לעיניים וקדמי לאוזניים.
5. הניחו את בעל החיים על כרית חום (37°C) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולייצב את ראשו של בעל החיים באמצעות מסגרת סטריאוטקסית.
6. יש לחטא את האזור המגולח ב-10% פובידון-יוד שלוש פעמים. עבור האזור הקרוב לעין, הימנעו משימוש בחומרי חיטוי על בסיס אלכוהול, בהתאם לסטנדרט הנוהג שנקבע על ידי איגוד הטכנולוגים הכירורגיים.
7. בצע חתך מדיאני-סגיטלי בראש עם אזמל ומבלו זה מעגל ~ בקוטר 20 מ"מ של רקמת העור כדי לחשוף את עצם הגולגולת.
8. הסר את periosteum הבסיסית על ידי גירוד וייבוש עם גזה כדי לחשוף את התפרים הגולגולתיים העטרה ו sagittal.
9. באמצעות בור דנטלי המחובר למקדחה, טרפן שני חורים (0.7 מ"מ קוטר, עומק ~ 1 מ"מ) דרך הגולגולת בשני חצאי הכדור בקואורדינטות הסטריאוטקסיות: 7 מ"מ קאודלי לברגמה, 3 מ"מ רוחבי לקו האמצע.
10. הברג ברגי נירוסטה (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ, מעוקר עם כלורהקסידין) לשני החורים המוכנים מראש עד לעומק של ~ 1 מ"מ (2 מ"מ בורג חשוף) כדי לאפשר עיגון יציב. זה יוצר קשר עם הדורה מבלי לפגוע ברקמת קליפת המוח הבסיסית.
11. הכינו את אזור הניתוח לאמלגם דנטלי על ידי ייבוש עצם הגולגולת בגזה, ומשיכת עור רפוי עם שני תפרים 3 - 0 בשעה ~ 4 ו -8.
12. פזרו אמלגם דנטלי על הגולגולת החשופה כדי לאבטח את אלקטרודות הבורג (ברגי נירוסטה המתוארים בשלב 1.10) במקומן. ודא ~ 1.5 מ"מ מהברגים נשארים חשופים להקלטה.
13. הסר את התפרים הנסוגים.
14. יש להזריק 0.5% קרפרופן תת עורית (5 מ"ג/ק"ג) לשיכוך כאבים ותמיסת מלח (נתרן כלורי 0.9%, 1.5 מ"ל) להחלפת נוזלים.
15. אפשרו לבעלי חיים להתאושש בכלובים נפרדים. אין להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
16. אין להחזיר את בעל החיים לחברתם של בעלי חיים אחרים עד שהחלים לחלוטין מהניתוח (מינימום 5 ימים).
17. המשך לתת 0.5% קרפרופן תת עורית לשיכוך כאבים (5 מ"ג / ק"ג) פעם ביום במשך 4 ימים.
18. רשום ERG ו- VEP שבוע לאחר הניתוח.

2. הקלטת ERG ו- VEP

1. הכנת איסוף נתונים
   1. השתמש בתוכנת מחשב כדי להפעיל גירוי בו זמנית ולרכוש נתונים בהתאם להגדרות המומלצות להלן.
      1. הגבירו את האותות (ERG: ×1,000, VEP: x10,000) כאשר הרווח נקבע באופן פנימי על ידי קדם-מגבר ומגבר מבודדים, ועם שתי עיניים מותאמות לעכבה.
      2. הגדר את קצב הדגימה עבור ה- ERG ל- 4 קילוהרץ בחלון הקלטה של 650 msec (2,560 נקודות), לשם כך, לחץ על הכרטיסייה עבור "בסיס זמן" בתוכנת איסוף הנתונים (עבור שם וגרסת התוכנה ראה טבלה עבור חומרים), בחר "2,560" עבור דוגמאות, ו- "500 ms" עבור זמן שיחזיר חלון הקלטה של 650 msec.
         1. השתמש באותה שיטה כדי להגדיר את קצב הדגימה עבור VEP ל- 10 kHz במהלך תקופה של 250 msec. אפשר התחלה בסיסית של גירוי מקדים של 10 msec הן עבור הקלטות ERG והן עבור הקלטות VEP. לשם כך, לחץ על הכרטיסייה "הגדרה"; בחר "מגרה" כדי להעלות חלון דיאלוג חדש; בחלון זה בחר "דופק" מהרשימה הנפתחת עבור "מצב"; והגדר את הערך עבור "עיכוב" ל- "10 אלפיות השנייה".
      3. הגדר סינון פסים של ERG ל- 0.3 - 1,000 הרץ ( - 3 dB). זה נעשה על ידי לחיצה על "Bio Amplifier" בתוכנת רכישת הנתונים. לאחר מכן הגדר את הערך עבור "מעבר גבוה" ל- "0.3Hz", ואת הערך עבור "מעבר נמוך" ל- "1 קילוהרץ".
      4. באמצעות השיטה הנ"ל ב- 2.1.1.3, הגדר הגדרות פס VEP ל- 0.1 - 100 הרץ (- 3 dB) כפי שהומלץ על ידי האגודה הבינלאומית לאלקטרופיזיולוגיה קלינית של ראייה (ISCEV) עבור רישומי VEP אנושיים.

2. הכנת אלקטרודות

1. הפוך את האלקטרודות ERG לפעילות/לא פעילות ולאלקטרודות VEP פעילות/לא פעילות על-ידי חיבור חוט כסף או תפס תנין לעופרת אלקטרודה, בהתאמה. להשיג אלקטרודה קרקעית מסחרית.
2. עבור 4 אלקטרודות בהתאמה אישית, חתכו את הקצה הגברי מהרחבת עופרת האלקטרודה. הסר 1 ס"מ מציפוי בידוד הפוליטטרה-פלואוראתילן החיצוני בלהב אזמל כדי להבטיח שהחוט הפנימי לא ייפגע.
3. עצבו מראש את האלקטרודות הלא פעילות של ERG על ידי חיתוך חוט כסף באורך 70 מ"מ (עובי 0.3 מ"מ) ויצירת לולאה ~ 8 מ"מ בקוטר כדי להקיף את עין החולדה. מכינים עיגול אחיד על ידי עיצוב הלולאה על קצה פיפטה 1 מ"ל.
4. טרום אופנה אלקטרודות VEP לא פעילות על ידי חיתוך אורך 70 מ"מ של כסף ויצירת אליפסה ~ 8 מ"מ בקוטר אורך לחיבור לחותכות חולדה.
5. עצבו מראש את האלקטרודות הפעילות של ERG על ידי חיתוך חוט כסף באורך 30 מ"מ ויצירת לולאה קטנה כדי ליצור מגע עדין עם קרנית החולדה (~ 1-2 מ"מ קוטר)
6. חבר היטב אלקטרודות (2 ERG פעיל, 2 ERG לא פעיל, 1 VEP לא פעיל) למוליך האלקטרודה על ידי שזירת הכסף עם החוט הפנימי החשוף.
7. בודד עודפי מתכת חשופה עם מסקינג טייפ כדי להפחית ממצאים פוטו-וולטאיים.
8. באלקטרודות הלא פעילות של ERG מדביקים חתיכה קטנה של מהדק וו ולולאה (~ 5 מ"מ × 20 מ"מ) למסקינג טייפ כדי לאפשר חיבור יציב לרצועת הצוואר של המכרסם.
9. חבר את תפס התנין לחוט הפנימי של מוליכי האלקטרודה כדי להפוך את האלקטרודות הפעילות של VEP.
10. לפני ההקלטות, אלקטרופלטה את המשטחים החשופים של חוטי הכסף (כלומר, הטבעת הלא פעילה והקצה הפעיל) עם כלוריד באמצעות מקור DC 9 V למשך 20 שניות כדי לשפר את הולכת האות.
    1. כדי לעשות זאת, לטבול את קצה הכסף של חוט אלקטרודת ERG (מתנהג כמו אנודה של תא ראשוני) לתוך מלוחים רגילים; ולחבר את הקצה השני של חוט אלקטרודה זה למסוף חיובי של סוללה 9 V.
    2. חברו חוט נוסף (הקתודה) למסוף השלילי של הסוללה, וטבלו גם את הקצה השני במי מלח. נתק לאחר 20 שניות והתבונן בקצה הכסף של חוט אלקטרודת ERG שיש לצפות באופן שווה בצבע לבן.
       הערה: הכן אלקטרודות ERG חדשות לכל מפגש ניסוי (~ עד 8 שעות) כדי להבטיח פטנט של ציפוי הכלוריד.

3. הכנת בעלי חיים

1. התאימו את החיות למשך הלילה (≥ 8 שעות) לפני ההקלטות בחדר אטום לאור. הבטיחו התאמה מרבית לחושך על ידי כיבוי אורות החדר וסגירת כל הדלתות והתריסים. צמצם את דליפת האור על ידי הצבת חומרים חסיני אור סביב צמתים של דלתות/חלונות והצבת מסכי מחשב מחוץ לווילונות שחורים עבים.
2. בצע הכנת בעלי חיים בחדר חשוך בעזרת דיודה עמומה פולטת אור אדום (LED; 17.4 ^cd.m-2, λ_max = 600 ננומטר) כדי לשמור על רגישות למוט.
3. מרדימים את החולדה על ידי הזרקת קטמין/קסילזין (60: 5 מ"ג/ק"ג) תוך שרירית. לאשר עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטת כפה.
4. כדי לשמור על טשטוש, יש לתת מנה נוספת של הרדמה (50% מהמינון הראשוני) לאחר 50 דקות במידת הצורך.
5. להרדמה מקומית נוספת יש למרוח טיפה אחת של פרוקסימטקאין 0.5% על כל עין, ולמצמץ את עודפי הנוזלים.
6. להרחבת אישון יש למרוח טיפה אחת של 0.5% טרופיקמיד על כל עין, ולאחר מכן לייבש נוזלים עודפים.

4. מיקום אלקטרודות ERG ו- VEP

1. הניחו את בעל החיים על משטח ERG מול קערת גנצפלד הממוקמת בכלוב פאראדיי. הימנע משימוש בכרית חימום חשמלית, מכיוון שהיא עלולה להכניס רעש חשמלי לרישומים האלקטרופיזיולוגיים.
   הערה: הפלטפורמה מחוברת לפלטפורמת מים מחוממת במחזור כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
2. אבטחו את בעל החיים לרציף באמצעות רצועה של מהדק וו ולולאה הממוקמים בחוזקה אך לא בחוזקה סביב העורף.
3. חברו את אלקטרודת ה-VEP הלא פעילה סביב החותכות התחתונות של החולדה המורדמת.
4. מקם את האלקטרודות הלא פעילות של ERG על ידי הקפת הטבעת הסקלרלית באופן לא פולשני סביב קו המשווה של העין. ייצב זאת על ידי חיבור אלקטרודות לרצועת ההידוק של הוו והלולאה סביב העורף. חזור על הפעולה עבור העין הנגדית.
5. הדקו אלקטרודות פעילות של VEP על ידי חיבור אטבי תנין לברגי נירוסטה שהושתלו מראש על הגולגולת.
6. יש להניח טיפה קטנה של נתרן קרבוקסימתילצלולוז 1% על הקרנית לפני מיקום האלקטרודה הפעילה ERG כדי לשפר את איכות האות.
   הערה: נוזל הוויסקוזה מסייע גם בשמירה על הידרציה בקרנית במהלך הניסויים כדי למזער את היווצרות הקטרקט מסוג דסיקציה במכרסמים.
7. יש להניח טיפה קטנה של נתרן קרבוקסימתילצלולוז 1% על החותכות התחתונות כדי לשפר את המגע של האלקטרודה הלא פעילה VEP ובכך את איכות האותות.
8. מקם את האלקטרודות הפעילות של ERG כדי לגעת קלות במשטח הקרנית המרכזי באמצעות מיקרומניפולטור המחובר לזרוע סטריאוטקסית שנבנתה בהתאמה אישית.
9. הכנס 2 - 5 מ"מ של אלקטרודת מחט הקרקע (נירוסטה) תת עורית לתוך הזנב.
10. במידת הצורך, יבשו את עודפי הנוזלים מהעפעף התחתון לפני ההקלטה כדי לשפר את איכות האות.
11. החלק את המשטח קרוב יותר לקערת גנצפלד כדי להבטיח שעיני החיה יתיישרו עם פתח הקערה כדי לאפשר הארה אחידה של שתי הרשתיות (ראה שלב 2.4.1).
12. סגור את כלוב פאראדיי כדי להפחית רעש חיצוני.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קליפ אליגטור	מותג גנרי	HM3022	תפס נירוסטה 26 מ"מ לחיבור אלקטרודות בורג VEP לכבלים
מגבר ביולוגי	אדינסוטרמנטים	ML 135	להגברת אותות ERG ו-VEP
Carboxymethylcellulose נתרן 1.0%	אלרגן	CAS 0009000-11-7	נוזל צמיג לשיפור איכות האות של אלקטרודת ERG פעילה
קרפרופן 0.5%	קבוצת פייזר לבריאות בעלי חיים	CAS 53716-49-7	שם קנייני: Rimadyl injectable (50 מ"ג / מ"ל). עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח, מדולל ל 0.5% (5 מ"ג / מ"ל) במי מלח רגילים
כלורהקסדין 0.5%	מעבדות אוריון	27411, 80085	לחיטוי כלי ניתוח
אמבט מים במחזור	לאודה-קוניגסהופן	MGW לאודה	לשמירה על חום הגוף של בעל החיים המרדים במהלך הניתוח ורישומים אלקטרופיזיולוגיים
אמלגם דנטלי	DeguDent GmbH	64020024	למעטפת מכלול האלקטרודה-גולגולת כדי להפוך אותה לחזקה יותר
בור שיניים	סטורץ אינסטרומנטס, באוש ולומב	#E0824A	ראש מקדח מיניאטורי בקוטר ~0.7 מ"מ ליצירת חור קטן בגולגולת מעל כל חצי כדור להשתלת ברגי VEP
מקדחה	בוש	סדרת Dremel 300	מקדחה אוטומטית לטרפנינג
עופרת אלקטרודה	דשא טלפקטור	F-E2-30	כבלי פלטינה לחיבור אלקטרודות חוטי כסף למגבר
פאראדיי קייג'	בהתאמה אישית		מבטיח עמידות לאור כדי לשמור על הסתגלות כהה. סוגר את מערך גנצפלד לשיפור יחס אות לרעש
מקלוני גזה	Multigate מוצרים רפואיים Pty בע מ	57-100 ב'	לייבוש החתך הניתוחי ומשטח הגולגולת החשוף במהלך הניתוח
המרחב המשלב של גנצפלד	פתרונות פוטומטריים בינלאומיים		ממריץ אור בעיצוב אישי: קוטר 36 מ"מ, צמצם 13 ס"מ
VELCRO	VELCRO אוסטרליה Pty בע מ	VELCRO מותג עטיפה לשימוש חוזר	מהדק וו ולולאה כדי לאבטח את האלקטרודות ואת החיה על פלטפורמת ההקלטה
איזופלורן 99.9%	Abbott Australasia Pty בע מ	CAS 26675-46-7	שם קנייני: Isoflo(TM) אינהלציה אנאאסתטית. חומר הרדמה נשימתי באיכות פרמצבטית מעורבב עם גז חמצן לניתוח השתלת אלקטרודות VEP
קטמין	מעבדות טרוי	איליום קטמיל	שם קנייני: Ketamil Injection, מותג: Ilium. הרדמה באיכות פרמצבטית להקלטה אלקטרופיזיולוגית
נורות Luxeon LED	פיליפס תאורה ושות'		לגירוי אור עשרים 5 וואט ונורות LED 1 וואט אחת.
מיקרומניפולטור	מכשיר הרווארד	BS4 50-2625	מחזיק את האלקטרודה הפעילה של ERG במהלך הקלטות
אלקטרודת מחט	דשא טלפקטור	F-E2-30	מוכנס תת עורית לזנב כדי לשמש כאלקטרודת הקרקע הן עבור ERG והן עבור VEP
פנילפרין 2.5% מינימום	באוש ולומב	CAS 61-76-7	הוטבע עם Tropicamide להשגת התרחבות מקסימלית להקלטת ERG
פובידון יוד 10%	סאנופי-אוונטיס	CAS 25655-41-8	שם קנייני: בטדין, חיטוי להכנת העור המגולח לניתוח 10%, 500 מ"ל
מערכת איסוף נתונים Powerlab	אדינסוטרמנטים	ML 785	שולט בנורות ה-LED
פרוקסימטקאין 0.5%	מעבדות אלקון	ע"א 5875-06-9	להרדמת הקרנית במהלך רישומי ERG
תמיסת מלח	גלפלקס		לא ניתן להזרקה, עבור אלקטרודות חוט כסף electrocilating
תוכנת סקופ	אדינסוטרמנטים	גרסה 3.7.6	מפעיל בו זמנית את הגירוי באמצעות מערכת Powerlab ואוסף נתונים
כסף (חוט עגול דק)	A&E מתכת	0.3 מ"מ	משמש לייצור אלקטרודות ERG פעילות ולא פעילות, ואלקטרודת VEP לא פעילה
ברגי סטרל מנירוסטה	מיקרו-פסטרנרים		קוטר פיר 0.7 מ"מ, אורך 3 מ"מ להשתלה מעל קליפת המוח הראייתית העיקרית ולשמש כאלקטרודות VEP הפעילות
מסגרת סטריאוטקסית	דוד קופף	דגם 900	מכשיר סטריאוטקסי של חיה קטנה לאיתור קליפות המוח הראייתיות הראשוניות על פי קואורדינטות אטלס מוח החולדות של פקסינוס ווטסון משנת 2007
להב כירורגי	סוואן-מורטון בע"מ	206	עבור חיתוך אזור העור המכסה את קליפת המוח הראייתית העיקרית להשתלת אלקטרודות VEP
תפר	שנגחאי Pudong Jinhuan רפואי מוצרים ושות', בע מ		3-0 תפר קלוע משי שאינו נספג, לנסיגת עור במהלך ניתוח השתלת אלקטרודות VEP
משחת עיניים טוברמיצין 0.3%	מעבדות אלקון	CAS 32986-56-4	שם קנייני: Tobrex. משחה אנטיביוטית מניעתית המיושמת סביב פצע העור לאחר הניתוח
טרופיקמיד 0.5%	מעבדות אלקון	CAS 1508-75-4	שם קנייני: 0.5% Mydriacyl eye drop, הוחדר להשגת mydriasis להקלטת ERG
קסילזין	מעבדות טרוי	איליום קסילזיל-100	הרדמה באיכות פרמצבטית להקלטה אלקטרופיזיולוגית
טיפ פיפטה	Eppendorf Pty בע מ	0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 מ"ל, עבור אלקטרודות בהתאמה אישית
הזרקת המתת חסד Lethabarb	Virbac (אוסטרליה) Pty בע מ	LETHA450	325 מ"ג / מ"ל נתרן pentobarbital עבור המתת חסד מהירה
Microsoft Office Excel	מיקרוסופט	גירסה 2010	תוכנת גיליונות אלקטרוניים לניתוח נתונים