גרימת דליות אקסונליות עם גירוי מיקרומכני על נוירונים

תקציר

מקור: Servello, D., et al. A Microbiomechanical System for Study Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את השראת הדליות האקסונליות על ידי הפעלת גירוי מיקרומכני על נוירונים. המערכת מורכבת ממיקרופיפטה המחוברת למזרק המכיל חיץ באמצעות צינורות. באמצעות מיקרומניפולטור, המיקרופיפטה ממוקמת מעל הנוירונים. לאחר מכן מופעל לחץ נוזל כדי לגרום לדליות באקסונים.

פרוטוקול

1. הגדרת מנגנון פיפטת הנשיפה

הערה: ישנם חמישה מרכיבים בסיסיים למערך זה: פיפטת הזכוכית, הצינור, המזרק, המיקרומניפולטור והמאגר (של האנק) טבלה 1. כל חיץ שיש לו ריכוזי מלח רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית יכול לשמש במערך זה.

1. משוך פיפטה בורוסיליקט כדי לקבל קצה פתיחה בקוטר 45 מיקרומטר באמצעות מושך מיקרופיפטה והמפרט בטבלה 2.
   הערה: נמצא כי 45 מיקרומטר הוא גודל מתאים לקוטר פתח פיפטה בתנאי ניסוי. שינויים קלים בגודל הפתיחה לא אמורים להשפיע באופן משמעותי על התוצאות. חשוב לציין כי סטיות גדולות יותר ממספר זה עדיין אמורות לעבוד עבור השראת דליות על ידי התאמת גובה המזרק המחובר לפיפטה באמצעות צינורות, אך הדבר ידרוש כיול מחדש של ערך הלחץ.
2. הכנס את הקצה הלא משוך של פיפטה לתוך צינורות גומי דקים.
   הערה: דופן הצינור צריכה להיות דקה ונוקשה כדי למזער את התנגדות הנוזלים, ולהבטיח כי גובה המזרק עומד ביחס ישר ללחץ הנוזל הזורם דרך פיפטה עם התנגדות זניחה. אורך הצינור צריך להיות לא יותר מ -0.6 מ 'כדי למזער עוד יותר את ההתנגדות.
3. חבר את הקצה השני של הצינור למזרק פלסטיק של 10 מ"ל באמצעות מחבר עם שסתום מסתובב.
   הערה: מזרק הפלסטיק צריך להיות מוחזק בגובה קבוע ומדיד כדי להבטיח מדידה מדויקת של הלחץ המשוער הזורם מהפיפטה. נעשה שימוש בגובה של 190 מ"מ מכיוון שהוא מספק לחץ מינימלי אך גורם באופן אמין לדליות באקסונים. ניתן להשתמש גם בערכי גובה אחרים אם הלחץ גורם לתאים להתנתק ממשטח הכיסוי. מומלץ להשתמש באותה הגדרה לאורך כל הניסוי.
4. הכנס את פיפטה לתוך ראש בורג של micromanipulator להחזיק את פיפטה במקום. הברג את בורג המתכת בעל הראש השטוח המחובר לזרוע המיקרומניפולטור כך שיחזיק את הקצה הלא משוך של הפיפטה בדיוק מעל המקום אליו מחובר צינור הגומי. זווית פיפטה בזווית של 45° עם פני השטח של הכיסויים המכילים נוירון. הערה: יש לבנות את המיקרומניפולטור כך שניתן יהיה להחזיק את הפיפטה מבלי להגביל את צינורות הגומי. המיקרומניפולטור חייב לאפשר תנועה של פיפטה בכיווני x, y ו-z כדי למקם אותה במדויק בטווח התאים. להלן גרפיקה ותצלום של המכשיר (איור 1).
5. הפעילו מסנן פלואורסצנטי, פתחו את הצמצם וודאו שניתן לראות נקודה פלואורסצנטית חודרת דרך המטרה. באמצעות המיקרומניפולטור, הזיזו את הפיפטה למצב המיישר את הקצה עם הכתם הפלואורסצנטי והורידו את הפיפטה למצב ממש מעל גובה צלחת תרבית התאים (35 מ"מ x 10 מ"מ). ברגע שהוא במקומו, הפעל את האור המועבר וכבה את הפלואורסצנציה.
6. בעזרת פינצטה מוסיפים כיסוי אחד (כשהתאים פונים כלפי מעלה לכיוון הפיפטה) מצלחת תרבית התאים לצלחת תרבית התאים המכילה כ-2 מ"ל חיץ של האנק בטמפרטורת החדר.
7. מניחים את צלחת התרבית המכילה את הכיסוי על ההיקף.
8. באמצעות ידית המיקוד העדינה והמטרה 20X, התמקדו במישור כארבעה סיבובים מלאים מעל התאים (כ-0.4 מ"מ). השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את קצה פיפטה כך שיהיה ממוקד ובמרכז הצד השמאלי של המישור כפי שנראה דרך חלקי העיניים.
   הערה: דנדריטים הם הקרנות שצריכות להיות באותה מסגרת כמו גוף התא שממנו הן נובעות. כדי לגרום לדליות אקסונליות, יש לעקוב אחר הקרנות ארוכות יותר מגוף התא לאקסונים מדיאליים ודיסטליים.

2. כיול הלחץ של פיפטה באמצעות מערכת קרום נמתח

1. הגדירו את מנגנון פיפטת הנשיפה עם אותם פרמטרים בדיוק כפי שתואר לעיל על גבי מערכת המכילה קרום סיליקון מיקרו-מפוברק (קוטר 500 מיקרומטר ועובי 50 מיקרומטר) ומקדו את המיקרוסקופ על פני השטח של הממברנה.
   הערה: מערכת זו נועדה למדוד ערכי לחץ קטנים, והסבר על המערכת כבר פורסם בעבר. מדידה זו צריכה להיעשות רק פעם אחת עבור ניסויי נשיפה אם משתמשים באותה הגדרה בדיוק של נשיפה.
2. מקדו את המיקרוסקופ במערכי המיקרו-נקודות (בקוטר 4 מיקרומטר ובהפרש של 10 מיקרומטר, כפי שנמדד בין מרכזים). סובב את שסתום העצירה ואפשר לנוזל לזרום מתוך הפיפטה. לבחון את הסטייה של הממברנה בתגובה ללחץ הנוזל עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
3. השתמש במודל ליניארי כדי לקבוע את הלחץ המתאים הקשור להטיית הממברנה.
   הערה: בעוד מחקר שנערך לאחרונה מצא כי סטייה של w= -3.143 ± 0.69 מיקרומטר התקבלה עבור גובה מזרק 190 מ"מ, זה יצר לחץ של 0.25 ± 0.06 nN/μm² ממערך פיפטה הנוכחי, אשר נמצא בטווח הפיזיולוגי והפתולוגי, אם כי גובה המזרק אינו הקובע היחיד. גורמים אחרים משפיעים גם על ערך הלחץ המדויק על תאי העצב, כולל פתיחת פיפטה, מיקום (מרחק וזווית) של קצה הפיפטה ביחס לתאים, ואפילו גמישות הצינור
.

3. נשיפה לגרימת דליות

1. ברגע שהפיפטה נמצאת במקומה, מקדו את המיקרוסקופ במישור המכיל אזור עניין. מקם את התאים והתהליכים בחצי השמאלי של שדה ההדמיה (נראה בצילום חי של המצלמה) בתוך אזור הנשיפה, בעוד שהחצי הימני נמצא מחוץ לאזור הנשיפה.
   הערה: בשל הצמיחה הנרחבת של אקסונים ודנדריטים של נוירונים, אין זה סביר שכל התהליכים של נוירון נמצאים באותו אזור נשיפה. זהו למעשה אחד היתרונות של שיטה זו, המאפשרת לבחון את ההשפעה המקומית של הנשיפה. ישנם שני סוגים של נשיפה שניתן להשתמש בהם כדי לגרום לדליות: נשיפה ממושכת ונשיפה דופקת.
2. התנשפות
   1. נשיפה ממושכת
      1. מקמו את המזרק בגובה, 190 מ"מ מעל הכיסוי המכיל נוירונים בתרבית. התחל הדמיה בהילוך מהיר של אזור עניין עם זמן חשיפה אופטימלי החושף מורפולוגיה עצבית ברורה. צלם לפחות 15 פריימים במרווח של 2 שניות (30 שניות בסך הכל) כקו הבסיס. ניתן לכוונן את המרווח בהתאם לניסוי. במסגרת 16, פתח את שסתום העצירה המסתובב של המזרק ואפשר לנוזל לזרום במשך 75 מסגרות (150 שניות). במסגרת 75, כבה את השסתום כך שזרימת הנוזל תיפסק. הפסק לכידת וידאו.
         הערה: זה אמור לגרום לדליות אקסונליות בתאי עצב 7-9 DIV בתוך 5-10 שניות, בעוד שלתאי עצב ישנים לוקח זמן רב יותר ליצור דליות.
   2. דופק (2 שניות) נשיפה
      1. מקמו את המזרק בגובה המתאים (190 מ"מ). התחל הדמיה בהילוך מהיר וצלם לפחות 15 פריימים (30 שניות) במרווח של 2 שניות. במסגרת 16, פתח את השסתום של המזרק ואפשר לנוזל לזרום, ואז סגור את השסתום לאחר 2 שניות. המתן 5-20 שניות (בהתאם לתדירות שיש לבדוק) לפני פתיחת השסתום שוב. חזור על פתיחה וסגירה של השסתום ליצירת פולסים נוזליים, והמשך לתקופה כוללת של 150-300 שניות. המשך בהדמיה בהילוך מהיר למשך 20 דקות כדי ללכוד את שלב ההתאוששות.
         הערה: כאשר המרווח ארוך מ -10 שניות, הפולסים גורמים פחות דליות באופן דרסטי. במרווח של 20 שניות, לא ניתן לגרום דליות על ידי הפולסים. כדי להשיג היווצרות דליות אמינה ועקבית, מומלץ שגובה המזרק צריך להיות סביב 190 מ"מ. אין להעלות את גובה המזרק ולחץ הנוזל לנקודה שבה התאים מתחילים להתנתק משטח הכיסוי.
3. לפני יום השימוש, נקו את המערך (פיפטה, צינורות ומזרק) על ידי הזרמת כ-10 מ"ל 70% אתנול דרך ההתקנה. לאחר שטיפת האתנול, יש להזרים 10 מ"ל מהמאגר של האנק (או החיץ הרצוי) דרך המערך כדי להכין את המערכת לשימוש באותו יום. לאחר סיום הניסויים ליום, לנקות את ההתקנה כפי שתואר קודם עם אתנול כדי למנוע צמיחה של מזהמים במהלך הלילה.

טבלה 1: מתכון החיץ של האנק. מתכון זה מכין את החיץ המשמש בפרוטוקול הנשיפה ובמהלך הדמיה של תאים חיים.

המאגר של האנק (מסנן, pH = 7.4, מאוחסן ב 4 °C
150 מ"מ	NaCl
4 מ"מ	KCl
1.2 מ"מ	MgCl2
1 מ"מ	CaCl2
10 מ"ג/מ"ל	D-גלוקוז
20 מ"מ	HEPES

טבלה 2: פרמטרים של משיכת פיפטה. מספק את הפרמטרים שיש להגדיר על מושך פיפטה כדי לקבל פתח בקוטר של כ -45 מיקרומטר.

פיפטה פרמטרים מושכים
חום	משך	מהירות	לעכב	לחץ	הרמפה
501	0	15	1	500	530

תוצאות

איור 1: סכמטי ותצלום של מכשיר נשיפה. (A) תצלומים המראים את מערך המיקרוסקופ הכולל. (B) מכשיר הנשיפה המראה את פיפטת הזכוכית המוחזקת על ידי המיקרומניפולטור ומחוברת לצינורות הגומי. (C) תמונות ניגודיות פאזה עם התמקדות במישור של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס המראות את הצל של פיפטה בפינה הימנית התחתונה. (D) המישור החוץ-תאי מתמקד בקצה פיפטה מתנפחת. (E) סכמת מרחקים ולחצים מחושבים לגרימת דליות. סרגל קנה מידה = ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות UBBER	פישר סיינטיפיק	14-169-1א
מזרק פלסטיק 10 סמ"ק ובוכנה	בקטון דיקינסון
מיקרומניפולטור	סאטר אינסטרומנטס
צלחת תרבית תאים (35 מ"מ x 10 מ"מ)	קורנינג	3294
דגם P-1000 מושך מיקרופיפטה בוער/חום	סאטר אינסטרומנטס
Eclipse TE2000-U Mcroscope	ניקון
תכנון עדשת Fluor ELWD 20x	ניקון	62933	המטרה
עדשת שמן Apo TIRF 100x/1.49	ניקון	MRD01991	המטרה
HEPES	פישר סיינטיפיק	BP410-500
D-גלוקוז	פישר סיינטיפיק	D16-500
MgCl2	פישר סיינטיפיק	BP214-500
NaCl	פישר סיינטיפיק	S640-3
KCl	פישר סיינטיפיק	BP366-500
CaCl2	פישר סיינטיפיק	C70-500