קביעת תצורת מהדק-מתח של תא שלם לרישומים אלקטרופיזיולוגיים בפרוסות מוח

תקציר

מקור: Sunstrum, J. K., et al. הערכת ריבוי סינפטי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי על כל התא. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים מיקום פיפטה מחודדת דקה ליד פרוסות מוח, ויוצר חותם עם תא עצבי. היניקה שוברת את קרום התא, ובכך יוצרת מהדק טלאי של התא כולו המאפשר מדידות נוכחיות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. פתרונות

1. פתרון חיתוך
   1. עיין בטבלה 1 להרכב תמיסת החיתוך.
   2. הכינו מראש תמיסת מלאי של 20x ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש.
   3. לתמיסת החיתוך 1x, יש להמיס את NaHCO₃, גלוקוז וסוכרוז ב-ddH₂O ולהוסיף את מלאי 20x. ודא שהאוסמולריות היא בין 315 ל 320 mOsm ואחסן את התמיסה לא יותר משבוע אחד ב 4 ° C.
   4. ממלאים שתי כוסות בתמיסת חיתוך של 100 מ"ל ומכסים אותן בפרפילם. מצננים את התמיסה במקפיא עד שהיא הופכת לקפואה חלקית (כ-20 דקות במקפיא של -80°C). בעזרת צינור פיזור גז, מבעבעים את שתי כוסות תמיסת החיתוך עם 95% O2/5% CO2 למשך 20 דקות על קרח.
2. aCSF (נוזל מוחי מלאכותי שדרתי), לשחזור ותחזוקה של פרוסות
   1. עיין בטבלה 1 להרכב ה- aCSF.
   2. הכינו מראש תמיסת מלאי של 20x ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש.
   3. עבור 1x aCSF, להמיס NaHCO3 וגלוקוז ב ddH2O ולהוסיף את מלאי 20x. ודא שהאוסמולריות היא בין 298-300 mOsm. השתמש בפתרון תוך יום אחד.
3. aCSF (נמוך Ca²⁺ להקלטה)
   1. עיין בטבלה 1 עבור הרכב Ca²⁺ aCSF נמוך.
   2. הכינו מראש תמיסת מלאי של 20x ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש.
   3. עבור Ca²⁺ aCSF נמוך אחד, יש להמיס NaHCO3 וגלוקוז ב-ddH2O ולהוסיף מלאי פי 20 (ללא CaCl2 ו-MgCl2), CaCl2 ו-MgCl2 לריכוזים שצוינו. ודא שהאוסמולריות היא בין 298-300. השתמש בפתרון תוך יום אחד.
4. aCSF (Sr²⁺ להקלטה)
   1. עיין בטבלה 1 להרכב Sr²⁺ aCSF.
   2. הכינו מראש תמיסת מלאי של 20x ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש.
   3. עבור 1x Sr²⁺ aCSF, יש להמיס NaHCO3 וגלוקוז ב-ddH2O ולהוסיף מלאי 20x (ללא CaCl2 ו-MgCl2), SrCl2 ו-MgCl2 לריכוזים שצוינו. ודא שהאוסמולריות היא בין 298-300. השתמש בפתרון תוך יום אחד.
5. פתרון פנימי
   1. עיין בטבלה 1 להרכב התמיסה הפנימית מבוססת K-gluconate.
   2. כדי לייצר 20 מ"ל של תמיסה פנימית, הוסף 15 מ"ל מים ברמה של ביולוגיה מולקולרית לצינור של 50 מ"ל. לאחר מכן, בצע את השלבים הבאים על קרח.
   3. הכינו מראש את התמיסות הבאות לריכוזי מלאי של 1 מ' במים בדרגת ביולוגיה מולקולרית. הוסף (במ"ל): 2.32 K-גלוקונאט, 0.24 Na-gluconate, 0.20 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 0.16 KCl, 0.05 K 2-EGTA (אשלגן אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N,N,N′,N′,N′-חומצה טטראצטית), 0.04 MgCl2 לצינור 50 מ"ל.
   4. להוסיף 100 μL של 0.3 M Na₃GTP (Guanosine 5′-triphosphate נתרן מלח)
   5. שקול 44.08 מ"ג של K2 ATP (אדנוזין 5′-טריפוספט מלח דיפוטסיום) בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל והוסף 1 מ"ל מים באיכות ביולוגיה מולקולרית, ולאחר מכן הוסף לצינור של 50 מ"ל.
   6. התאם את ה- pH ל- 7.2-7.4 עם 1 M KOH. ודא שהאוסמולריות היא בין 283-289 mOsm.

2. הכנת פרוסות

1. הכנת כלים
   1. הוסף 200 מ"ל של aCSF לתא ההתאוששות (בנוי מכוס 250 מ"ל עם 4 בארות ורשתות) ומקם את תא ההתאוששות באמבט מים (35 מעלות צלזיוס).
   2. כסו את התא בסרט פרפין ובעבעו ללא הרף את ה-aCSF עם 95% O2/5% CO2 באמצעות צינור פיזור זכוכית למשך 20 דקות לפחות.
   3. הגדר את כלי הדיסקציה (אזמל, מספריים עדינים זוויתיים, מלקחיים, מברשת צבע עדינה, כף פלסטיק).
   4. מלא מזרק 60 מ"ל עם כ 15 מ"ל של תמיסת חיתוך קר כקרח משלב 1.1.4.
   5. הכינו את משטח הדיסקציה על ידי הנחת נייר סינון על מכסה צלחת באר.
   6. מכינים את תא החיתוך על ידי הנחתו במגש הקרח וממלאים את המגש בקרח.
   7. הגדר את הוויברטום על ידי אבטחת להב חד פעמי במחזיק הלהב.
   8. להכנת פיפטת העברה, שוברים את קצה פיפטת פסטר ומניחים נורת גומי על הקצה השבור.
2. לנתח את מוח העכבר
   1. מרדימים את בעל החיים בחדר רווי 4% isoflurane עד רפלקסים בעמוד השדרה נעדרים.
   2. ערפו את ראשו של בעל החיים באמצעות גיליוטינה והסירו במהירות את המוח.
      1. בצע חתך קו אמצע עם להב אזמל מס '22 מרוסטרל לקאודל.
      2. לרוחב, לקלף את הקרקפת בכל צד של הראש.
      3. השתמש מספריים עדינים לחתוך את הגולגולת בצד אחד מ caudal כדי rostral (כולל הצד של העצמות הקדמיות), בזהירות לא לפגוע במוח.
      4. השתמש במלקחיים כדי להרים את פיסת הגולגולת מהמוח ולקרר במהירות את המוח עם 15 מ"ל של תמיסת חיתוך קרה כקרח באמצעות המזרק משלב 2.1.4.
      5. הרימו את המוח מהגולגולת.
      6. הניחו את המוח באחד הכוסות המלאות בתמיסת חיתוך קרה כקרח (משלב 1.1.4) מבעבעת עם 95% O2/5% CO2.

3. הכינו פרוסות של היפותלמוס עכבר.

1. חסום את המוח עבור אזור המוח הרצוי וזווית חיתוך (למשל, עבור פרוסות היפותלמוס קורונלי, לחתוך את רוסטרל הרקמה לכיאזמה האופטית ואת הקאודלי לפונס באמצעות להב ולוודא שלבלוק הקאודלי יש משטח שטוח בניצב לבסיס המוח).
2. בעזרת פיסת נייר פילטר חתוכה, הרימו את המוח מהצד הקדמי והדביקו את הצד האחורי לצלחת האחיזה באמצעות דבק מיידי.
3. הניחו במהירות את צלחת האחיזה בתא החיתוך ומלאו אותה בתמיסת החיתוך מהכוס השנייה בשלב 1.1.4.
4. הדקו את תא החיתוך ואת מגש הקרח על הוויברטום.
5. מגדירים את אזור החיתוך (קדמי ואחורי למוח) ומתחילים לחתוך פרוסות קורונליות בעובי 250 מיקרומטר. פרמטרים מומלצים: מהירות 0.10 מ"מ לשנייה, משרעת 2 מ"מ.
6. חתכו את הפרוסות לגודל המתאים לאזור המוח הרצוי.
7. לשחזר את הפרוסות ב 35 ° C במשך 30-45 דקות. לאחר מכן, הוציאו את תא ההתאוששות מאמבט החימום ואפשרו לפרוסות להתאושש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות. שמרו את הפרוסות בטמפרטורת החדר למשך שארית היום והמשיכו לבעבע את האמבטיה ללא הרף עם 95% O2/5% CO2.

3. Whole-cell Patch ClampRecording

1. משוך את פיפטות המדבקה.​
   1. באמצעות הפרמטרים המוצעים להקלטת התא כולו מהמדריך של מושך הפיפטה, משוך פיפטות טלאי מזכוכית בעלת דופן עבה להתנגדות פיפטה של 3-5 MΩ.
   2. באמצעות מזרק (מסחרי או תוצרת בית), למלא קצה פיפטה עם פתרון פנימי מסונן. כדי להכין מזרק מיקרו, שרפו את קצה מזרק 1 מ"ל ואפשרו לקצה ליפול, מה שיוצר קצה ארוך ודק.
2. השג את תצורת התא כולו.
   1. מניחים את פיפטת ההקלטה ממש מעל הפרוסה ומקזזים את זרם הפיפטה במצב מהדק מתח. הפעילו לחץ חיובי קל על הפיפטה ונעלו את הסטופקוק.
   2. בחר תא בריא עם קרום שלם ולגשת אליו עם פיפטה. הלחץ החיובי אמור לגרום להפרעה קלה ברקמה (כלומר, גל איטי ברקמה בעת הכניסה).
   3. לאט לאט ממשיכים לקרב את פיפטה לתא בתנועה אלכסונית עד שהפיפטה יוצרת גומה קטנה על פני התא.
   4. שחררו את נעילת הלחץ החיובי. התא יתחיל ליצור חותם, וההתנגדות תגדל מעל 1 GΩ. במהדק המתח, החזק את התא ב -68 mV.
   5. התרחק מעט מהתא באלכסון כדי להסיר לחץ עודף מהתא.
   6. פצה על קיבול פיפטה מהיר ואיטי.
   7. יש לבצע יניקה קצרה דרך הצינור המחובר למחזיק פיפטה כדי לפרוץ את התא ולקבל תצורה של תא שלם.
   8. עבור למצב תא בחלון בדיקת הממברנה בתוכנת אלקטרופיזיולוגיה לאיסוף וניתוח נתונים (לדוגמה, Clampex).
   9. לפני כל רישום מהדק מתח, בצע בדיקת ממברנה באמצעות אותה תוכנה ורשום את הפרמטרים הרלוונטיים בספר מעבדה (התנגדות ממברנה, התנגדות גישה וקיבול).
   10. שמור על הטמפרטורה של אמבט ההקלטה ב 27-30 ° C ואת קצב הזרימה על 1.5-2.0 מ"ל / דקה עבור ניסויים הבאים.

טבלה 1: הרכב הפתרונות השונים.

	ריכוזי תמיסה (mM)
	חיתוך	aCSF רגיל	Caנמוך 2+ aCSF	Sr+ aCSF	פיפטה/פנימית
NaCl	87	126	126	126	-
KCl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0.5	2.5	0.5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	2
נה"ה 2ת.ד. 4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
גלוקוז	25	10	10	10	-
סוכרוז	75	-	-	-	-
קיי-גלוקונאט	-	-	-	-	116
נא-גלוקונאט	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K 2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0.3

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל מזרק	ב.ד.	309659
10 להבים	פישר סיינטיפיק/אחרים	35698
22 להבים	VWR/אחרים	21909-626
22 מסנני מזרק uM	מיליפורה	09-719-000
Adson foreceps	הרווארד אינסטרומנטס	72-8547
מספריים חדים זוויתיים	הרווארד אינסטרומנטס	72-8437
קלמפקס	התקנים מולקולריים	pClamp 10
להב בעל קצה כפול	VWR	74-0002
נייר סינון	סיגמא/אחרים	1001090
מברשת צבע עדינה	פישר/שונים	15-183-35/שונים
צינור פיזור גז	VWR	LG-8680-120
איזופלורן	Fresenius Kabi/אחרים	M60303
דבק קרייזי	מגוון	מגוון
מיני אנליזה	סינפטוסופט	מיניאנליזה 6
אוסמומוטר	Wescor Inc	דגם 5600
פארפילם	סיגמא	PM-996
פיפטה פסטר	VWR	14672-200
מד PH	מטלר טולדו	FE20-ATC
נורת גומי	VWR	82024-550
ידית אזמל מס' 3	הרווארד אינסטרומנטס	72-8350
ידית אזמל מס' 4	הרווארד אינסטרומנטס	72-8356
להב בעל קצה יחיד	VWR	55411-050
כלי פריסה Vibratome	לייקה	VT1200S
מערכת טיהור מים	מיליפור	מילי-קיו אקדמי A10
ובכן מכסה צלחת	פישר/שונים	07-201-590/שונים
CaCl2 2H2O	סיגמא	C7902
CdCl2	סיגמא	202908
EGTA	סיגמא	E3889
גלוקוז	סיגמא	G5767
HEPES	סיגמא	H3375
K2-ATP	סיגמא	A8937
KCl	סיגמא	עמ' 9333
קיי-גלוקונאט	סיגמא	G4500
MgCl2 6H2O	סיגמא	M2670
מים בדרגת ביולוגיה מולקולרית	סיגמא	W4502-1L
Na3GTP	סיגמא	G8877
NaCl	ביושופ	SOD001.1
נא-גלוקונאט	סיגמא	S2054
NaH2PO4	סיגמא	71504
NaHCO3	סיגמא	S6014
פיקרוטוקסין	סיגמא	עמ' 1675
SrCl	סיגמא	255521
סוכרוז	ביושופ	SUC507.1