כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. דור פלסמיד pHuC_Mermaid
הערה: בת הים היא ביו-חיישן שפותח על ידי זיווג תחום חישת המתח (VSD) של חיישן המתח Ciona intestinalis (כיום Ciona robusta) המכיל פוספטאז (Ci-VSP) עם פלואורופורים פלואורופורים Umi-Kinoko Green (mUKG: תורם) וגרסה מונומרית של החלבון הפלואורסצנטי הפולט כתום Kusabira Orange (mKOk: acceptor). עבור ביוסנסור זה, שינויים קונפורמטיביים של תחום VSD, המושרים על ידי דפולריזציה של הממברנה, מגדילים את הקרבה של חלבונים פלואורסצנטיים התורם והמקבל, ובכך מגדילים את העברת האנרגיה ביניהם (הגדלת יחס FERET). ה- VSD מבטיח לוקליזציה יעילה של הביוסנסור בקרום הפלזמה. הביטוי העצבי של הביוסנסור (בחוט השדרה, האות ניתן לזיהוי הן בנוירונים והן בנוירונים מוטוריים) מושג על ידי שיבוט מסגרת הקריאה הפתוחה של בת הים (ORF) תחת המקדם הפאן-עצבי של דג הזברה HuC.
- הגבירו על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) את מסגרת הקריאה הפתוחה של בת הים (ORF) מפלסמיד בת הים pCS4+ עם Pfu (הגהה) DNA פולימראז באמצעות פריימר אוניברסלי T3 ופריימר בת הים SmaI (5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) על מנת להכניס אתר הגבלת SmaI במעלה הזרם של ORF בת הים.
- השתמש בתערובת ה- PCR הבאה: 0.5 μL של Pfu DNA פולימראז, 7.5 μL של מאגר 10x הספציפי, 1 μL של 10 mM deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), 2.5 μL של dimethyl sulfoxide (DMSO), 0.5 μL (50 ng) של הכנת פלסמיד, ו 1 μL של 20-μM תמיסות מלאי של כל פריימר בנפח כולל של 50 μL.
- חממו את תערובת ה-PCR במשך 15 שניות ב-95°C, הפריימו אותה למשך 15 שניות ב-50°C והאריכו אותה למשך 4 דקות ב-72°C למשך 35 מחזורים בסך הכל.
- ג'ל לטהר את מוצר ה-PCR הקהה הספציפי באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרית, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- שכפל את מקטע ה- DNA לווקטור הקהה pCMV-SC בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- לינארית את הפלסמיד החיובי לבת הים (הנקרא pCMV-SC_Mermaid) עם אנזים ההגבלה SmaI עבור ההחדרה הבאה של מקדם HuC.
- הגדר את תגובת ההגבלה באופן הבא: 0.5 μL (10 U) של אנזים הגבלת SmaI, 2 μL של מאגר הערכה 10x, ו- 5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד בנפח כולל של 20 μL. דגור על התגובה ב- 25 ° C למשך שעה אחת.
- ג'ל לטהר את הפלסמיד המעוכל באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- PCR - להגביר את מקדם HuC (pHuC), עם Pfu DNA פולימראז ו DNA גנומי של דגי זברה כתבנית, באמצעות זוג פריימרים ספציפיים ל- HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA ו- HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) ומשתרע על פני אזור של 3,150 bp במעלה הזרם של ATG.
- הגדר את תערובת ה- PCR באמצעות התוכנית הבאה: 0.5 μL של Pfu DNA פולימראז, 7.5 μL של מאגר 10x הספציפי, 1 μL של 10 mM dNTPs, 2.5 μL של DMSO, 200 ng של DNA גנומי, ו 1 μL של 20-μM תמיסות מלאי של כל פריימר בנפח כולל של 50 μL.
- לאחר שלב ראשוני של 2 דקות ב-95°C, חממו את תערובת ה-PCR למשך 15 שניות ב-95°C, הכינו אותה למשך 15 שניות ב-50°C והאריכו אותה למשך 4 דקות ב-72°C למשך 35 מחזורים בסך הכל.
- ג'ל לטהר את מוצר ה-PCR הקהה הספציפי באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- לקשור כמות שווה ערך של pCMV-SC_Mermaid מטוהר (שלב 1.5) ואת ה- pHuC DNA (שלב 1.7) באמצעות 1 μL של ליגאז T4 DNA ו 1 μL של מאגר 10X ספציפי בנפח כולל של 10 μL. לדגור על התגובה במשך 16 שעות ב 4 ° C.
- הפוך aliquot של תאים מתאימים עם 5 μL של תגובת הקשירה (שלב 1.8) בהתאם להוראות היצרן.
- בחר את השיבוטים החיוביים ל- pHuC (pHuC_Mermaid) כאשר המקדם מוכנס בכיוון הנכון על ידי עיכול כפול של Sal I-EcoRV (אתר ההגבלה Sal I הוכנס במעלה הזרם של מקטע המקדם בשלב 1.6, בעוד שאתר הגבלת ה- EcoRV ממוקם במורד הזרם של אזור הפוליאדנילציה, PolyA, של פלסמיד pCMV-SC).
- הגדר את תגובת ההגבלה באופן הבא: 0.5 μL (10 U) של אנזימי הגבלת SalI ו- EcoRV, 2 μL של מאגר kit10X, ו- 1 מיקרוגרם של pHuC_Mermaid- DNA בנפח כולל של 20 μL. לדגור על התגובה ב 37 ° C במשך 1 שעות. הפעל את התגובות על ג'ל אגרוז.
2. מיקרו-הזרקה לעובר
- מעבירים את הביצים המופרות המתקבלות מזן בר (זן AB) או מדג זברה בוגר Sod1-G93R לצלחת פטרי בקוטר 10 מ"מ באמצעות פיפטה מפלסטיק.
- שוטפים את העוברים במי דגים קרים (4 מעלות צלזיוס) ומיד מזריקים אותם במיקרו לחלמון עם 200 גרם של פלסמיד pHuC_Mermaid באמצעות מיקרו-מזרק (לתיאור כולל ומפורט של הליך המיקרו-הזרקה).
- בעזרת פיפטה מפלסטיק מעבירים את העוברים לצלוחית פטרי ודורים עליהם במי דגים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי (20-24 שעות לאחר ההפריה, HPF) לצורך הניתוחים הבאים.
3. ניתוח סליל זנב ספונטני
הערה: הערך את התנהגות סלילת הזנב הספונטנית בעוברים של 20-24 HPF עם או בלי התרופה riluzole.
- מעבירים עובר לצלחת פטרי עגולה בקוטר 90 מ"מ מלאה במי דגים המכילים 0.2% DMSO (רכב רילוזולי) ומפרקים אותו ידנית באמצעות שני מלקחיים של תכשיטן עם קצוות חדים. לדגור על העובר במשך 5 דקות.
- זהה את סלילת הזנב בטמפרטורת החדר (RT) במהלך הקלטת וידאו של דקה באמצעות מצלמה דיגיטלית המורכבת על סטריאומיקרוסקופ. רכוש סדרות זמן ברזולוציית זמן של 30 פריימים לשנייה.
- חישוב התדירות של סלילי זנב ספונטניים על ידי ספירת מספר העיקולים (הן קונטרלטרליים והן איפסילטרליים) ליחידת זמן.
- כדי להעריך את ההשפעה של התרופה riluzole, להשתמש בעדינות פיפטה פסטר פלסטיק להעביר את העובר לצלחת פטרי חדשה 90 מ"מ מלא במי דגים המכיל 5 מיקרומטר riluzole.
- לדגור על העובר במשך 5 דקות לפני הקלטת וידאו של דקה וביצוע ניתוח התנהגותי כאמור לעיל.
4. מערך הדמיה להדמיית ביוסנסור של בתולת ים בעוברים חיים: זיהוי סימולטני של אותות תורם ומקבל
- הרכיבו את 20 - 24 עוברי HPF באגרוז 1% נקודת התכה נמוכה במי דגים ב 37 ° C בתוך צלחת הדמיה 35 מ"מ עם תחתית זכוכית. לכוון את העוברים על צידם. ממתינים עד שהאגרוז מתמצק בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את צלחת ההדמיה לשלב של קונפוקל הפוך המורכב על מיקרוסקופ הפוך. זהה נוירונים מוטוריים המבטאים את הביו-חיישן עם מטרה של 20X (צמצם מספרי 0.7, NA) על-ידי הפעלת ה-mUKG עם קו לייזר ארגון 488 ננומטר ורישום הפליטה שלו בין 495 ל-525 ננומטר.
- למדידת FET, הרגש את mUKG, התורם של זוג FET, עם קו לייזר 488 ננומטר. לזהות בו זמנית, באמצעות סורק תהודה הפועל ב-8,000 הרץ במצב דו-כיווני, את הפלואורסצנטיות הנפלטת מהתורם (בין 495 ל-525 ננומטר) ואת הפלואורסצנטיות הנפלטת על ידי מקבל mKOk (בין 550 ל-650 ננומטר, ערוץ FET). אם זמין, השתמש במדפסת לייזר 473 ננומטר.
הערה: יעילות העירור של התורם תפחת מעט (85% במקום 93% עם 488 ננומטר), אך העירור הצולב של המקבל יופחת גם כן (מ-17% עם קו לייזר של 488 ננומטר ל-9% עם קו לייזר של 473 ננומטר).
- כדי להפחית פוטוטוקסיות והלבנה פלואורופורית, מזערו את ההארה של הדגימה על ידי הפחתת עוצמת קו הלייזר (בחלון נתיב הקרן של תוכנת הרכישה).
- מטב את העירור כדי להתאים את פרמטרי הרווח וההיסט שנקבעו בתחילת הניסוי ונשמרים קבועים לאורך כל הסשן. לקביעת ההסטה, שנו את צבע התמונה לערכי עוצמה (באמצעות טבלת בדיקת המידע Q), ובשעת סריקה כשמד הלייזר כבוי, סובבו את ידית ההסטה (הסטה חכמה) כך שהעוצמה של הפיקסלים ברקע תהיה מעט גבוהה מאפס. עם אותה טבלת חיפוש, על ידי הפעלת הלייזר בזמן הסריקה, סובב את כפתור ההגברה (רווח חכם) כדי למקסם את יחס האות לרעש, תוך זהירות להימנע מפיקסלים רוויים.
- באמצעות חור סיכה פתוח (2 יחידות אווריריות), קבל תמונות של 16 סיביות כדי לספק טווח דינמי מספיק לניתוחים כמותיים. הימנע מממוצע כדי להגדיל את מהירות הרכישה ולמזער את ההלבנה.
- בחלון רכישת תוכנה, בחר גודל שדה תמונה של 512 x 64 פיקסלים (גודל פיקסל: 605 ננומטר) מהתפריט הנפתח.
- בחלון מצב רכישה, בחר xyt (קיטוע זמן במישור xy יחיד) from בתפריט הנפתח ורשום את השינויים במתח נוירון עמוד השדרה העוברי על ידי רכישת מישור xy יחיד, הגדרת פרמטרי הרכישה להקליט תמונה אחת כל 30 אלפיות השנייה למשך דקה אחת.
- כדי להעריך את ההשפעה של ניהול riluzole על depolarization הממברנה באותו נוירון, לרכוש מערך נתונים חדש 5 דקות לאחר תוספת של מי דגים המכילים 5 מיקרומטר riluzole.
- לניתוח FET, השתמש Biosensor_FRET המאקרו ImageJ (המבטא ביו-חיישנים של FRET בעל שרשרת יחידה.)
- הערך את יחס FRET של הממברנה הבסיסית של כל נוירון ב- t1 כ- ((ממוצע FRET - רקע RET)/(ממוצע תורם - רקע תורם)), כאשר העוצמה הממוצעת של FRET ו- Donor היא עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת המחושבת באותו אזור עניין (ROI) המשורטט סביב התא עבור כל ערוץ שנרכש ו- FRET ורקע התורם היא עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת המחושבת בהחזר השקעה של שדה הראייה ללא הדגימה הפלואורסצנטית.
הערה: תיאור מפורט שלב אחר שלב של השימוש בתוסף ניתן למצוא באתר www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
- השתמש בתוכנת גרפים כדי להשוות את התדירות, המשרעת ומשך הזמן של דפולריזציה בין פרדיגמות ניסוי שונות. השווה בין שתי קבוצות באמצעות מבחן t של סטודנט לא מזווג ושקול ערכים ממוצעים כשונים סטטיסטית כאשר P <0.05.
