רישום אלקטרופיזיולוגי של תגובות מתח של פוטורצפטורים ברשתית דרוזופילה לגירויי אור

תקציר

מקור: Juusola, M., et al. שיטה אלקטרופיזיולוגית לרישום תגובות מתח תוך תאיות של פוטורצפטורים דרוזופילה ונוירונים בין-עצביים לגירויי אור ב- Vivo. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לרישום אלקטרופיזיולוגי של פעילות קולטני אור בעין של דרוזופילה משותקת, המאפשר מדידה מדויקת של שינויי מתח בתגובה לגירויי אור.

פרוטוקול

1. הקלטה מ-R1-R6 Photoreceptors

1. יש להארקה תמיד בעת הפעלת מגבר המיקרואלקטרודות (למשל על ידי נגיעה במשטח המתכת של כלוב פאראדיי או שולחן נגד רטט), מכיוון שהדבר מונע מאדם להעביר בטעות מטען סטטי לשלב הראש, מה שעלול לגרום נזק למעגלים.
2. האר את מוט פלטפורמת הכנת הזבובים מלמעלה באמצעות שני מדריכי אור צוואר אווז (איור 1A) (עם מקור האור הקר בתוך כלוב פאראדיי) כך שניתן יהיה למקם את מחזיק הזבוב על המוט במיקום המועדף תחת שליטה חזותית צמודה.
3. הרכיבו את מחזיק הזבוב (עם הזבוב בתוכו!) על מוט פלטפורמת הכנת הזבובים. סובבו את מחזיק הזבוב כך שעינו השמאלית של הזבוב תפנה ישירות אל החוקר (איור 1B).
4. הכניסו את אלקטרודת הייחוס הקהה בעדינות דרך האוצ'לי של הזבוב לתוך קפסולת הראש באמצעות מיקרומניפולטור גס קטן תוך התבוננות בהכנה דרך הסטריאומיקרוסקופ (איור 1C). אל תדחפו את האלקטרודה עמוק מדי, מכיוון שזה יכול לפגוע במוח הזבוב.
   1. לחלופין, הכנס את אלקטרודת הייחוס לחלק האחורי של בית החזה. יש לוודא תמיד שהזבוב נראה בריא (מזיז את האנטנות שלו), ועיניו שלמות, ולא ניזוקו בטעות. אם ההכנה נראית פחות ממצוחצחת, הכינו זבוב חדש לניסויים.
5. הניעו את מיקרואלקטרודת ההקלטה החדה לעין שמאל דרך פתח קטן מכוסה ג'ל נפט. השתמש בהגדלה גבוהה בסטריאומיקרוסקופ והזז את מדריכי האור ואת מישור המוקד כך שמיקום קצה האלקטרודה יתברר בתלת-ממד על ידי דפוסי ההחזרה שלו.
   הערה: איור 1D מראה כיצד יש למקם את ראש הזבוב (ביחס לזווית שבה מיקרואלקטרודת ההקלטה נכנסת לעין) לצורך הקלטות קולטני אור. דחיפת האלקטרודה לעין מבלי לשבור אותה היא השלב הקשה ביותר של הניסוי. אם קצה האלקטרודה מפספס את הפתח הקטן בעין, ופוגע בקרנית, הוא בדרך כלל נשבר.
6. הפעל את מגבר המיקרואלקטרודות ברגע ששתי האלקטרודות נמצאות היטב בתוך התכשיר, במגע חשמלי עם נוזלי הגוף של הזבוב.
7. כבו את מקור האור הקר (בתוך כלוב פאראדיי) ונתקו אותו מהחשמל. חבר את התקע שלו לקרקע המרכזית כדי למזער את הרעש החשמלי הנגרם בלולאת הקרקע ולהרחיק את מדריכי האור של צוואר האווז כך שניתן יהיה להזיז את מערכת זרוע קרדן בחופשיות סביב הזבוב. כבו את אורות החדר כדי לוודא שהכנת הזבוב נמצאת כעת בחושך יחסי.
8. למדוד את ההתנגדות של אלקטרודת ההקלטה בעין. השתמש רק באלקטרודות הקלטה שבהן ההתנגדות היא 100 - 250 MΩ.
   הערה: השגת הקלטות תוך-תאיות באיכות גבוהה על ידי אלקטרודה של <70 MΩ היא כמעט בלתי אפשרית. אם ההתנגדות היא <80 MΩ, סביר להניח שקצה האלקטרודה נשבר. במקרה זה, כבה את המגבר ושנה את אלקטרודת ההקלטה.
9. הגדר את המגבר למצב מהדק זרם (CC) או מצב הקלטת גשר. בטל כל הפרש מתח שרירותי בין אלקטרודות ההקלטה והייחוס, מכיוון ששתיהן מונחות כעת בחלל החוץ תאי המחובר חשמלית, על ידי הגדרת היסט האות (מתח הקלטה) לאפס. עקוב אחר שינויי הסטת האות באמצעות קריאת התצוגה של המגבר או מסך אוסצילוסקופ.
10. המתינו 2-3 דקות עד שעין הזבוב תסתגל כהה.
11. הניעו את קצה אלקטרודת ההקלטה עמוק יותר לתוך העין בצעדים קטנים של 0.1 עד 1 מיקרון. עשה זאת עם צעד פיאזו ציר X של מיקרומניפולטור הנשלט מרחוק או על ידי סיבוב עדין של ידית הרזולוציה העדינה של מניפולטור ידני.
12. לעורר את עין הזבוב עם הבזקי אור קצרים (1 - 10 מילישניות) כאשר אלקטרודת ההקלטה מתקדמת ברקמה.
    הערה: אם אלקטרודת ההקלטה ממוקמת ברשתית והעין מתפקדת כרגיל, כל הבזק אור יגרום לירידה קצרה וקטנה במתח (היפרפולריזציה של 0.2 - 5 mV), הנקראת אלקטרורטינוגרמה (ERG). שינוי זה בפוטנציאל השדה של החלל החוץ תאי נגרם על ידי התגובה הקולקטיבית של תאי הרשתית לאור.

תוצאות

איור 1. מיקום מחזיק הזבוב והאלקטרודות לניסויים. (א-ב) מחזיק הזבוב ממוקם על פלטפורמת ההקלטה המספקת גם בקרת טמפרטורה באמצעות אלמנט פלטייה (A: פלטפורמה עגולה לבנה במרכז). זרוע קרדן מאפשרת מיקום מדויק של גירוי האור במרחק שווה (באמצעות סיבוב x,y) סביב הזבוב, כאשר מקור האור (קצה צרור סיב אופטי נוזלי או קוורץ) מצביע ישירות לעין שלו. ברבות מהאסדות שלנו, גירוי האור נוצר על ידי נורות LED (עם דרייברים של זרם לי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ זום סטריאופוני להכנת הזבוב	אולימפוס	SZX12 DFPLFL1.6x PF עיניות: WHN30x-H/22	מסוגל ~ 150X הגדלה עם מרחק עבודה ארוך; מעמד להרכבה שולחנית פלדה כבדה בהתאמה אישית
סטריאומיקרוסקופ במערך התוך-תאי	· אולימפוס	אולימפוס SZX7; משקפיים: WHN30x-H/22	עיניות 30X דרושות כדי לראות היטב את השתקפויות קצה האלקטרודה כאשר דוחפים אותה דרך חור הקרנית הקטן לתוך העין
מיקרוסקופ Nikon	Nikon SMZ645; משקפיים: C- W30x/7
שולחן נגד רעידות	מלס גריוט	עם חורי M6 מטריים על קרש הלחם	באסדות המותאמות אישית שלנו יש חור גדול שנקדח דרך לוח הלחם העבה שמאפשר להיכנס לעמוד פלטפורמת הכנת הזבובים (מכיל מפזר חום מנחושת עם אלקטרוניקה) מלמטה
ניופורט
מיקרומניפולטורים	נארישיגה	נארישיגה NMN-21	במערכים התוך-תאיים שלנו, מערכות מיקרו-מניפולטור שונות משמשות להנעת אלקטרודות הקלטה של הגאפ לתוך עין הזבוב. כל המניפולטורים המפורטים מספקים בהצלחה הקלטות יציבות ארוכות טווח מפוטורצפטורים ו- LMC של דרוזופילה.
האקסלי ברטרם	ציר האקסלי xyz עם שליטה ידנית עדינה
סנסאפקס	ציר משולש Sensapex
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K עם צעד piezo נוסף בציר x ובקר MS 314
מעמדים מגנטיים	כל בסיס מגנטי עם מתג הפעלה/כיבוי יעשה		לדוגמה, כדי לנהל כבלים בתוך כלוב פאראדיי
מחזיקי אלקטרודות	מכשיר הרווארד	ESP/W-F10N
חוט כסף	מכשירים מדויקים בעולם	AGW1510	קוטר 0.3 - 0.5 מ"מ; צריך להיות כלוריד עבור מחזיקי האלקטרודות
מקור אור סיבים אופטיים	רבים ושונים, כולל אולימפוס
חבילות סיבים אופטיים	טכנולוגיית UltraFine		כדי לספק את גירוי אור ה- LED למערכת הזרוע של קרדן. אנו משתמשים הן במדריכי אור נוזלי והן במדריכי קוורץ (בטווח שבין UV ל- IR)
Thorn Labs
לעוף Cathing Tube		P80-50P 50ml סנט. צינור PP., חבילה של 100 יח	חותכים את התחתית החרוטית מצינור צנטריפוגת פלסטיק 50 מ"ל ומדביקים עליה קצה פיפטה של 1 מ"ל.
מערכת רכש דיגיטלית	מכשירים לאומיים
זרם / מתח אלקטרודה בודדת - מגבר מיקרואלקטרודה מהדק	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ מוצרים/מגברים/שנייה יחידה- electrode-clamp/sec-10lx.html	שחקן יוצא מן הכלל!
ראש הבמה	רגיל ( +/- 150 nA)	עבור npi SEC-10LX
מקורות אור LED ודרייברים	OptoLED דו-ערוצי (Cairn Research Ltd., בריטניה)		רבות ממערכות התמריצים שלנו בנויות בתוך הבית
עיצוב עצמי ובנייה
תוכנות רכישה וניתוח	חברות רבות לבחירה		Biosyst; מערכת מבוססת Matlab בהתאמה אישית לעבודה ניסויית ותיאורטית במעבדת Juusola
מחשב אישי או Mac			ודא שה-PC או ה-Mac תואם למערכת ולתוכנה לרכישת נתונים
מערכת זרוע קרדן	עיצוב עצמי ובנייה		מתן מיקום מדויק של x,y,z של גירויי האור
מערכת בקרת טמפרטורה פלטייה	עיצוב עצמי ובנייה
פאראדיי קייג'	בנייה עצמית		מיגון רעשים אלקטרומגנטי
נימי זכוכית בורוסיליקט נימיים		קוטר חיצוני: 1 מ"מ
קוטר פנימי: 0.5 - 0.7 מ"מ
נימי זכוכית קוורץ נימיים		קוטר חיצוני: 1 מ"מ
קוטר פנימי: 0.5 - 0.7 מ"מ
פיפטה פולר	חברת סאטר אינסטרומנט	דגם P-2000 לייזר בוער/חום Micropipette Puller	עבור אלקטרודות ייחוס בורוסיליקט, השתמש בתוכנית המוגדרת מראש #11 (אלקטרודות תיקון): חום = 350; נימה = 4; מהירות 36; עיכוב = 200).1.2.1). עבור אלקטרודות הקלטה בורוסיליקט, השתמש בתוכנית מוגדרת מראש #12 (זה בדרך כלל מושך חדים קונבנציונליים טובים עבור הקלטות photoreceptor): חום = 355; נימה = 4; מהירות 50; עיכוב = 225; משיכה = 150. עבור הקלטות LMC, הדורשות אלקטרודות עם קצוות עדינים יותר, יש להתאים ערכים אלה. למשיכת נימי קוורץ, מדריך P-2000 מציע תוכניות עבור מיקרואלקטרודות עדינות. הפרמטרים הקבועים מראש של תוכניות אלה משמשים כנקודות התחלה שימושיות עבור שינויים שיטתיים כדי ליצור אלקטרודות עם הצלחה חדירה טובה רעש הקלטה נמוך.
פתרון רינגר חוץ-תאי לאלקטרודת הייחוס	כימיקלים מפישר סיינטיפיק	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, סוכרוז	ראה את המתכון בסעיף הפרוטוקול
פתרון KCl 3 M למילוי מיקרואלקטרודת ההקלטה החוטמית	מלחים מפישר סיינטיפיק	10010310, KCl
ג'ל נפט	וזלין

זאת ' עצמית עצמית עצמית