ניטור אותות חשמליים מתאי עצב Afferent בזחל של דג זברה משותק

תקציר

מקור: Lunsford, E. T., et al. פעילות של נוירונים אפרנטיים בקו האחורי הצידי במהלך שחייה בדגי זברה. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים רישום של אותות חשמליים מתאי עצב afferent בזחל זברה משותק על ידי מיקום מיקרופיפטה ליד גנגליון הקו הצידי ויצירת חותם רופף ללכידת אותות. התמיסה החוץ תאית שומרת על הכדאיות העצבית בתהליך זה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת חומרים לרישומים אלקטרופיזיולוגיים

1. הכינו צלחת הקלטה עם תחתית אלסטומר סיליקון.
   1. יש לפזר שכבה דקה של רכיבי אלסטומר סיליקון המתערבבים מעצמם (למשל, סילגארד) לתוך צלחת תרבית רקמה מכוסה בתחתית זכוכית עד שהיא מתיישרת עם שפת באר רדודה. כ 0.5 מ"ל מספיק.
   2. מכסים ומרפאים את התבשיל למשך 48 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.
2. צור סיכות נתיחה.
   1. באמצעות ספק כוח DC, ספק מטען שלילי (5 V) לכוס חריטה של 100 מ"ל (3M KOH) וחבר חוט טונגסטן (0.002 אינץ '; קוטר 50.8 מיקרומטר) לפלט הטעון חיובית.
      זהירות: חוטים שליליים וחיוביים לא צריכים ליצור קשר זה עם זה במהלך הליך זה, מכיוון שאתה עלול להסתכן בייצור ניצוצות, שעלולים להוות סכנת שריפה פוטנציאלית.
   2. יש לחרוט את חוט הטונגסטן על ידי טבילה מהירה וחוזרת ונשנית של הקצה באמבט החריטה עד שהקצה מצטמצם לנקודה חדה. תחת סטריאומיקרוסקופ, לחתוך את החוט כ 1 מ"מ מן הקצה עם סכין גילוח ישר קצה. חזור על הפעולה שלוש פעמים נוספות, ולאחר מכן הכנס סיכות לצלחת ההקלטה שנרפאה באמצעות מלקחיים עדינים.
3. הכינו אלקטרודות הקלטה.
   1. באמצעות מושך מיקרופיפטה אופקי עם חוט להט קופסה, משכו צינור נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר פנימי: 0.86 מ"מ, קוטר חיצוני: 1.50 מ"מ) לתוך אלקטרודות עם קצה בקוטר 30 מיקרומטר עם טייפר קל (איור 1 Ai) שישמשו לרישום נוירונים afferent מהקו הצידי האחורי.
   2. משוך צינור נימי זכוכית בורוסיליקט נוסף לתוך זוג אלקטרודות עם קוטר קצה קטן יותר (1-5 מיקרומטר). מחזיקים אלקטרודה אחת בכל יד, מעבירים בעדינות את הקצוות אחד על השני כדי לשבור אותם לזווית ~ 30 מעלות. בעזרת מיקרופורג', מלטשים את הקצה המשופע עד לקבלת מרקם חלק.
4. צור את הפרוטוקול בתוכניות הקלטה אלקטרופיזיולוגיות.
   1. ודא ששלב הראש הימני מחובר לכניסת ערוץ 1 בחלק האחורי של זרם המיקרואלקטרודה ומגבר מהדק המתח עבור הקלטות הנוירון afferent.
      הערה: מפרטי המחשב עבור מגבר מהדק הזרם והמתח דורשים באופן מינימלי מעבד של 1 Ghz או טוב יותר, Windows XP Pro או Mac OS X 10.46.6, כונן תקליטורים עם זיכרון RAM של 512 MB, שטח כונן קשיח של 500 MB ושתי יציאות USB.
   2. פתח את תוכנת המגבר הנשלטת על-ידי מחשב.
   3. הגדר את ערוץ 1 למצב מהדק נוכחי על ידי לחיצה על לחצן IC.
   4. הזן את הפרמטר הבא תחת הכרטיסייה I-Clamp 1. תפוקה עיקרית: פוטנציאל קרום AC 100x (100,000 mV/mV), רווח: 1,000, בסל: 1 קילוהרץ, AC: 300 הרץ, היקף: עקיפה. תפוקה משנית: פוטנציאל קרום AC 100x (100 mV/mV), רווח: 1, מסנן Lowpass: 10 הרץ.
   5. שמור את פרמטר הערוץ כ- Ch1_Aff.
   6. התקן ופתח את תוכנת האלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון.
   7. לחץ על הגדר ובחר Lab Bench כדי להגדיר את האותות האנלוגיים על ידי הוספת Ch1_Aff לערוצי Digitizer (לדוגמה, Analog IN #0 ו- Analog IN #1) המחוברים באמצעות כבל קואקסיאלי BNC ליציאות Channel 1 Scaled Outputs התואמות של המגבר. לחץ על OK.
      הערה: דרישות המחשב המינימליות עבור הדיגיטציה הן: מעבד 1 Ghz או טוב יותר, Windows XP Pro או Mac OS X 10.46.6, כונן תקליטורים זיכרון RAM בנפח 512 MB , שטח דיסק קשיח בנפח 500 MB ושתי יציאות USB.
   8. לחץ על רכוש ובחר פרוטוקול חדש.
   9. בכרטיסיה מצב/קצב, בחר פער חופשי; תחת מצב רכישה, הגדר את אורך הניסיון לשימוש בשטח דיסק זמין (כלומר, הקלט עד לעצירה) או לערכה הרצויה משך (hh:mm:ss), ולאחר מכן הגדר את קצב הדגימה לאות (Hz) ל- 20,000 כדי למקסם את הרזולוציה.
   10. תחת הכרטיסיה קלט, בחר את ערוצי IN אנלוגיים שתצורתם נקבעה בעבר (בשלב 1.4.6) ובחר Ch1_Aff עבור הערוץ המתאים.
   11. תחת הכרטיסיה פלטים, בחר Cmd 0 ו- Cmd 1 עבור ערוץ #0 וערוץ #1, בהתאמה.
       1. חבר את הפקודה Channel 1 במגבר לפלט אנלוגי 0 בדיגיטציה באמצעות כבל קואקסיאלי BNC.
   12. שאר הכרטיסיות יכולות להישאר תחת הגדרות ברירת המחדל. לחץ על אישור ושמור את הפרוטוקול.

2. הכנת פתרון

1. הכן את הפתרון של האנק: 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na₂HPO₄, 0.44 mM KH₂PO₄, 1.3 mM CaCl₂, 1.0 mM MgSO₄, 4.2 mM NaHCO₄; pH 7.3. לדלל ל -10% מהתמיסה של האנק על ידי הוספת נפח מתאים של מים נטולי יונים.
2. הכינו את התמיסה החוץ תאית: 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 2.1 mM CaCl₂, 10 mM גלוקוז ומאגר HEPES 10 mM, pH 7.8 מותאם עם NaOH. סנן ואקום את התמיסה החוץ תאית דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
3. הכן α -bungarotoxin: להמיס 1 מ"ג של lyophilized α bungarotoxin בתמיסה תאית 10 מ"ל לייצר 0.1% דילול
.
4. הכינו תמיסת המתת חסד: 50% (מ"ג/ליטר) MS-222 חוצץ באיכות פרמצבטית ב-10% תמיסת האנק.
   זהירות: α-bungarotoxin הוא רעלן עצבי רב עוצמה המשתק שרירים על ידי חסימת קולטנים cholinergic. יש צורך בכפפות ומומלץ להגן על העיניים בעת הטיפול במשותק.

3. הכנת זחלים לרישומים אלקטרופיזיולוגיים

1. לשתק זחלי זברה.
   1. השתמש בזחלים מאוכלוסיית דגי הזברה שגודלו במעבדה (Danio rerio; 4-7 ימים לאחר ההפריה) ובית בתמיסת עובר (10% תמיסה של האנק) ב 27 מעלות צלזיוס.
   2. בעזרת פיפטה גדולה מעבירים את הזחל מהמארז לצלחת פטרי קטנה (35 מ"מ) ומסירים כמה שיותר מהתמיסה שמסביב.
      הערה: הוצאת תמיסת העובר מונעת דילול המשותק ומגבירה את יעילותו. ניתן להשתמש בפינה של מגבון משימה כדי לנדף את תמיסת העובר שנותרה, וחשוב מאוד לא לבוא במגע עם הזחלים או להשאיר אותם חשופים לאוויר.
   3. יש לטבול את הזחלים ב-10 מיקרוליטר של 0.1% α-בונגרוטוקסין למשך כ-5 דקות.
      הערה: הזמן הדרוש כדי לשתק זחלים משתנה בין ההכנות. תכשיר בריא תלוי במעקב צמוד, זרימת דם מהירה ומתמשכת וירידה בתגובות המוטוריות. חשיפת יתר קצרה למשותק עלולה להוביל לירידה איטית בבריאות הכללית של התכשיר, גם לאחר שטיפה יסודית. עדיף לשטוף לפני הזחל הוא משותק לחלוטין בזמן שהוא עדיין מראה סימנים של תנודות שרירים עדינות.
   4. שטפו את הזחל המשותק בתמיסה החוץ תאית והתרחץ במשך 10 דקות.
      הערה: השטיפה מאפשרת לזחל לעבור מתנודות שרירים עדינות לשיתוק מוחלט. כמו כן, α-bungarotoxin הוא אנטגוניסט של קולטן אצטילכולין ניקוטיני (nAChR) α9-subunit, המהווה מרכיב קריטי של מעגל משוב אנדוגני פרוטוקול זה מבחין; עם זאת, השפעה זו הוכחה כהפיכה בתאי שיער של קסנופוס ודגי זברה לאחר שטיפה של 10 דקות.
2. סיכה דגים בצלחת ההקלטה.
   הערה: הרדמה (למשל, MS-222, טריקאין) אינה נדרשת בעת הכנת דגי זברה זחלים (4-7 dpf) מכיוון שהיא מפריעה לבריאות בעלי החיים. למעשה, דגי זברה זחלים פטורים מפרוטוקולים מסוימים של בעלי חוליות.
   1. בעזרת פיפטת העברה, מעבירים את הזחל מאמבט התמיסה החוץ תאית לצלחת ההקלטה בעלת תחתית הסיליקון. ממלאים את שארית המנה בתמיסה חוץ-תאית.
   2. תחת סטריאומיקרוסקופ, מקמו בעדינות את הזחלים בעזרת מלקחיים עדינים מעל מרכז מזרן הסיליקון, הצד הצידי כלפי מעלה, כאשר הקצוות הקדמיים והאחוריים של הגוף רצים משמאל לימין, בהתאמה. לאחר מכן אחזו בסיכה חרוטה משטיח הסיליקון באמצעות מלקחיים עדינים והכניסו את הסיכה, אורתוגונלית לסיליקון, דרך הנוטוכורד הגבי של הזחלים ישירות גבי לפי הטבעת. הכניסו את הסיכה השנייה דרך הנוטוכורד קרוב לקצה הזנב והכניסו את הסיכה השלישית דרך הנוטוכורד הגבי של שלפוחית הגז (איור 1B).
      הערה: בעת החדרת סיכות, חשוב לכוון למרכז רוחב הנוטוכורד כדי למנוע פגיעה בזרימת הדם או פגיעה בשרירים שמסביב. הנוטוכורד הוא גבי לעצב הקו הלטרלי האחורי, כך שעם הצמדה נכונה, לא צפוי נזק לנוירונים התחושתיים של הקו הצידי. יש להכניס לאחר מגע ראשון כדי לא להפריע לרקמה שמסביב. באופן אידיאלי, קוטר הסיכה הוא פחות ממחצית רוחב הנוטוכורד כדי להבטיח הכנסה נקייה. אם הפינים חורגים מרוחב זה, חזור על שלב 1.2 עד להשגת רוחב הסיכה הרצוי. אם זרימת הדם מואטת לאחר ההצמדה, חזור על הפעולה משלב 1.3 ואילך עם דגימה חדשה.
   3. הכניסו את הסיכה הרביעית דרך השלפוחית האופטית תוך מתן סיבוב קל לכיוון החלק הקדמי כאשר הסיכה מוחדרת לתוך המעטפת (איור 1B). כאשר סיבוב קל מוחל, שימו לב לרקמה שבין הקליתרום לשלפוחית האופטית כדי לחשוף את אשכול הסומטה האפרנטית.
      הערה: החדרה זוויתית של הסיכה הרביעית נועדה להבטיח את חשיפת גנגליון הקו הצידי האחורי, אשר נחסם אחרת על ידי השלפוחית האופטית הגדולה.

4. רישום נוירונים Afferent

1. מלאו את אלקטרודת ההקלטה האפרנטית ב-30 μL של התמיסה החוץ-תאית, הכניסו אותה למחזיק פיפטה בשלב הראש הימני (איור 1B, C), והורידו אותה לתמיסת הכלים תוך הפעלת לחץ חיובי (1-2 מ"מ כספית) המיוצר על-ידי מתמר פנאומטי.
2. אתר וחבר באופן רופף לגנגליון afferent קו לטרלי אחורי.
   1. באמצעות מיקרומניפולטור, מנמיכים את קצה האלקטרודה עד שהיא מחזיקה מעמד מעל הקליתרום.
   2. הגדל את ההגדלה לטבילה פי 40 ואתר את ההצטלבות של עצב הקו הצידי האחורי והקליתרום. עקבו אחר הקו הקדמי של עצב הקו הצידי מהקליתרום למקום שבו הסיבים מעצבבים את הקו האחורי הצידי של גנגליון אפרנטי, שניתן להבחין בו על-ידי הצביר הבדיד של סומא (איור 1F).
   3. מביאים את קצה האלקטרודה מעל הגנגליון afferent ומורידים את פיפטה עד שהקצה בא במגע עם האפיתל. בעדינות, לתמרן את האלקטרודה כך שכל היקף קצה מגע עם גנגליון afferent.
   4. הפעל לחץ שלילי (20-50 מ"מ כספית) עם המתמר הפנאומטי והחזק.
      הערה: הלחץ השלילי המופעל על גנגליון afferent הוא עדין. הגברת הלחץ השלילי יכולה לשפר את האות לרעש, אך בריאות תאי העצב יורדת תחת יניקה אגרסיבית מתמשכת, מה שמקטין את ההסתברות להקלטה מוצלחת.
3. רשום פעילות נוירונים afferent.
   1. שלב הראש השמאלי צריך להיות מחובר למגבר, אשר מעביר את האות המוגבר לתוך דיגיטציה המפיק את האות האמור לתוך תוכנת אלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון להיות מנוטר במחשב סמוך.
   2. ב pClamp10, לחץ על כפתור Play בסרגל הכלים כדי לפקח על נוירונים afferent.
   3. ודאו שכל התא, רישום טלאי רופף של תאי עצב afferent מושג ברגע שקוצים מתרחשים באופן ספונטני, בערך כל 100-200 מילישניות (איור 1E).
   4. בהדרגה, הגדל את לחץ האלקטרודה של נוירון ההקלטה בחזרה לאטמוספרי (0 מ"מ כספית) והחזק למשך שארית ההקלטה.

תוצאות

איור 1: הקלטה אלקטרופיזיולוגית סימולטנית של נוירון אפרנטי קו אחורי צדדי ופעילות שורש מוטורי גחוני. (A). דוגמה של אלקטרודות רישום של טלאי רופף (i) ושורש מנוע גחוני (ii). פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר. (B) דגי זברה זחלים משותקים ומוצמדים בארבעה מקומות (סמלי צלב) לצלוחית סילגארד לרישום יציבות. צלבים מודגשים מייצגים נקודות הכנסה של פי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 מ"ל	פירקס	1000	כלי קיבול לחריטה
מטרה של טבילה במים פי 10	אולימפוס	UMPLFLN10xW	הגדלה נמוכה למיקום הזחלים ואלקטרודת הקלטה
מטרת טבילה במים פי 40	אולימפוס	LUMPLFLN40XW	הגדלה גבוהה יותר למיקום קצה האלקטרודה וביסוס מהדק טלאי
כבלים קואקסיאליים BNC	ThorLabs	2249-C-12	חיבור ערוצי מגבר ודיגיטציה; דרוש 4
נימי זכוכית בורוסיליקט עם חוט להט	וורנר אינסטרומנטס	G150F-3	קוטר פנימי: 0.86, קוטר חיצוני: 1.50; זכוכית נימית המשמשת ליצירת אלקטרודות הקלטה
מחשב	לא ישים	לא ישים	כל מחשב צריך לעבוד
ספק כוח DC	טנמה	72-420	משמש לחריטה חשמלית של פיני דיסקציה
אלקטרופיזיולוגיה דיגיטציה	מכשירי אקסון, התקנים מולקולריים	Axon DigiData 1440A	מאפשר רכישה של נתוני מהדק טלאי
נימה	חברת סאטר אינסטרומנט	FB255B	חוט תיבה בקוטר 2.5 מ"מ המשמש במושך מיקרופיפטה
מלקחיים עדינים	כלים מדעיים משובחים	Dumont #5 (0.05 x 0.02 מ"מ) מק"ט: 11295-10	משמש לתפעל זחלים ולהכניס סיכות
מיקרוסקופ DIC שלב קבוע	אולימפוס	BX51WI	מיקרוסקופ המשמש להדמיה והקמת הקלטות מהדק טלאי
קצה פיפטה גמיש ומחודד	פישר סיינטיפיק	02-707-169	קצוות גמישים מאפשרים החדרה לאלקטרודת הקלטה כדי לפזר תמיסה חוץ-תאית בקצה
פלואורודיש	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	מכסים את צלחת ההקלטה עם תחתית הזכוכית
KimWipe	קימטק	34155	מגבון משימה המשמש לניכוי עודפי נוזלים מהזחלים
קוויק-גארד	World Precision Instruments Inc.	710172	אלסטומר סילגרד בערבוב עצמי
מגבר מיקרואלקטרודות	מכשירי אקסון, התקנים מולקולריים	MultiClamp 700B	מגבר מהדק טלאי להקלטות ערוץ כפול
מיקרופורג'	נארישיגה	MF-830 מיקרופורג'	כדי ללטש אלקטרודת הקלטה
יחידת בקרת מיקרומניפולטור	סיסקיו	MC1000-eR/T	מתאם חיוג 4 צירים לשליטה במיקרומניפולטור
מושך מיקרופיפטה	חברת סאטר אינסטרומנט	בוער/חום P-97	למשיכת זכוכית נימית לאלקטרודות הקלטה
יחידת בקרה במיקרוסקופ	סיסקיו	MC1000e	מיקום המיקרוסקופ סביב השלב הקבוע וההכנה
מיקרומניפולטור ממונע	סיסקיו	MX7600	ממקם את במת הראש ואת אלקטרודת ההקלטה המחוברת להקלטת מהדק טלאי
מפקד MultiClamp	התקנים מולקולריים	2.2.2	ניתן להורדה מדף ההורדה של Axon MultiClamp 700B Commander
שולחן אוויר אופטי	ניופורט קורפוריישן	VH3036W השטח הפלסטיני הכבוש	שולחן בידוד Breadboard לצוף במיקרוסקופ ולמזער רעידות במהלך הקלטות
pCLAMP	התקנים מולקולריים	10.7.0	ניתן להורדה מתוכנת Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis דף הורדה
צלחת פטרי	בז	35-3001	משמש לטבול זחלים בשיתוק
מחזיק פיפטה	התקנים מולקולריים	1-HL-U	החזק אלקטרודת הקלטה וחבר לבמת הראש
מתמר פניאומטי	מכשור ביו-רפואי Fluke	DPM1B	לשליטה בלחץ הפנימי של אלקטרודת ההקלטה
אשלגן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	221473-25G	תחריט לתחריט סיכות דיסקציה
צינורות סיליקון	טייגון	14-169-1א	צינורות לחיבור מתמר פניאומטי למחזיק פיפטה
סטריאומיקרוסקופ	קרל זיס	סטמי 2000-C	משמש כדי לדמיין טיפים סיכה במהלך הכנת הזחלים
סכין גילוח בעל קצה ישר	קאנופוס	הזמנה מ amazon.com	חותך את חוט הטונגסטן תוך יצירת פיני דיסקציה
מזרק	בקטון דיקינסון קומפוני	309602	מלא בתמיסה חוץ-תאית להזרקה לאלקטרודות הקלטה
העברת פיפטה	סיגמא-אולדריץ'	Z135003-500EA	פיפטה חד פעמית, לא סטרילית להעברת זחלים
טריקאין מתאן-סולפונט	סינדל	12854	תרופות הרדמה המשמשות להרדת זחלים במינון גבוה.
חוט טונגסטן	World Precision Instruments Inc.	715500	0.002 אינץ ', קוטר 50.8 מיקרומטר; משמש להכנת סיכות דיסקציה
יחידת סינון ואקום	סיגמא-אולדריץ'	SCGVU11RE	יחידות סינון ואקום חד-פעמיות, סטריליות, המשמשות לעיקור תמיסה חוץ-תאית המשמשת לצלצול אלקטרודות אלקטרופיזיולוגי
ראש מהדק מתח זרם מהדק	התקנים מולקולריים	CV-7B	מסופק עם מגבר MultiClamp 700B המשמש כראשי תיבות שמאליים וימניים
α-בונגרוטוקסין	תרמופישר	B1601	לשיתוק הזחלים לפני ההקלטה