$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת פרוסות מוח חריפות בהיפוקמפוס
- הכנת תמיסות פרוסות
- הכן תמיסת חיתוך סוכרוז 500 מ"ל המורכבת מ: 194 mM סוכרוז, 30 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, 1.2 mM NaH2PO4 ו- 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, רווי ב- 95% O2 ו- 5% CO2.
- הכן 1-2 ליטר של תמיסת הקלטה (נוזל מוחי מלאכותי, ACSF) המורכבת מ: 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2, 1.2 mM NaH2PO4 ו- 26 mM NaHCO3; pH 7.3 - 7.4 (לאחר בעבוע), 290 - 300 mOsm, רווי עם 95% O2 ו 5% CO2. מלאו המכילה תא מחזיק פרוסות מוח בתמיסת הקלטה ושמרו אותה בטמפרטורה של 32-34°C. מלאו את תא הוויברטומה ברפש מי קרח.
- הכנת פרוסה חריפה
- מרדים עכבר עמוק על ידי הנחתו בצנצנת פעמון טעונה מראש עם 2-3 מ"ל isoflurane. בדוק אם רפלקס צביטת הבוהן אינו מגיב, ערוף את ראשו במהירות באמצעות זוג גזירים חדים או גיליוטינה כפי שפרוטוקול בעלי החיים שלך דורש.
- בצע חתך של 2-3 ס"מ באמצעות גזירים מהחלק הקאודלי של הגולגולת כדי לחתוך את הקרקפת לאורך קו האמצע. תוך כדי משיכה ידנית של הקרקפת, יש לבצע שני חתכים אופקיים בקוטר 1 ס"מ מהפתח המגנום לאורך צידי הגולגולת. לאחר מכן, באמצעות חריצים עדינים, חתכו חתך לאורך הגולגולת, לאורך קו האמצע מהחלק האחורי של הגולגולת לאף.
- בעזרת מלקחיים עדינים המוחדרים סמוך לקו האמצע, מחזירים את הגולגולת החתוכה לשני חלקים. חלץ את מוח העכבר מהגולגולת והשתמש בלהב כדי להסיר את המוח הקטן ואת נורות הריח, אשר ממוקמים בהתאמה בחלקים caudal ו rostral של המוח. אלה יכולים להיות מזוהים על ידי סדקים גדולים, אשר מפרידים אותם מן קליפת המוח.
- הרכיבו את בלוק המוח על מגש הוויברטום באמצעות דבק על. מלאו את מגש הוויברטום בתמיסת חיתוך קרה כקרח.
- חתכו קטעי רקמה במישור העטרה בעובי 300 מיקרומטר. בדרך כלל, ניתן לאסוף 6 פרוסות היפוקמפוס קורונליות.
- לאחר חיתוך כל חלק, מעבירים מיד את הפרוסות לפרוסה המחזיקה את הכד שחומם ל-32-34 מעלות צלזיוס. שמרו את הפרוסות בטמפרטורה זו למשך 20 דקות לפני הסרת הכד המכיל את החלקים והניחו אותן בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות לפחות לפני ההקלטה.
2. מדידה של דינמיקת K+ מעוררת חשמלית
- הכנת הפרוסה
- מניחים בעדינות את פרוסת המוח באמבטיה באמצעות פיפטה של פסטר ומחזיקים אותה בעדינות במקומה עם נבל פלטינה עם חוטי ניילון.
- ודא שקצות האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית מקבילים זה לזה וישרים עם מישור הפרוסה. לאט לאט, במשך 6-7 שניות, מחדירים את האלקטרודות לשכבת CA3 רדיאטום בעומק של כ-40-50 מיקרומטר כדי לעורר את בטחונות שפר. בחתכים קורונליים, CA3 יכול להיות מזוהה בקירוב כחלק של ההיפוקמפוס הנכון לרוחב לשכבת תאי הגרגיר בסוג ההיפוקמפוס, כאשר שכבת רדיאטום נופלת מדיאלית וגחונית לשכבת התא הפירמידלית.
- הכנס בזהירות את האלקטרודה הסלקטיבית K+ לרדיאטום שכבה CA1 בעומק של כ-50 מיקרומטר, על ידי הנמכה איטית של האלקטרודה במשך כ-3-4 שניות. תנו לפוטנציאל להתייצב על פני האלקטרודה לפני הפעלת גירויים על הפרוסה: פעולה זו נמשכת בדרך כלל 5 עד 10 דקות. אם הפרוסה מציגה שינויים ספונטניים ב-K+ חוץ-תאי, השליכו וחזרו על התהליך הזה עם פרוסה חדשה.
- מדידת שחרור K+ מעורר
- הפעל רכבות של גירוי חשמלי (8 פעימות) על ידי לחיצה ידנית על ההדק על הממריץ תוך רישום דיגיטלי של תגובות. החל גירוי ברוחב פולס של 10 הרץ ואלפית שנייה אחת, החל ממשרעת גירוי של 10 μA.
- החל אמפליטודות גירוי גדלות פי 2 עד לזיהוי משרעת תגובה מקסימלית של K+. אם אינך רואה תגובה כלשהי, קרב את מיקום אלקטרודת K+ לאתר הגירוי במרווחים של 100 מיקרומטר
- קבע את משרעת הגירוי שמייצרת את התגובה החצי המקסימלית. מניסיוננו, מדובר על בין 40-160 μA, תלוי באיכות ההכנה, גיל בעל החיים והמרחק בין אלקטרודות גירוי לאלקטרודה סלקטיבית K+.
- באותה פרוסה, באמצעות משרעת גירוי בצעד אחד נמוך יותר מהמשרעת שמייצרת את התגובה החצי מקסימלית (למשל, אם 80 μA מייצר תגובה חצי מקסימלית, השתמש ב-40 μA) הפעל רכבות גירוי של מספר גדל והולך של פולסים. בתחילה, השתמשנו ברכבות של 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 ו 128 פולסים.
- כדי לוודא שאותות K+ מתווכים על ידי ירי פוטנציאלי פעולה של אמבט בטחונות שפר המגורה חשמלית, יש למרוח 0.5 מיקרומטר טטרודוטוקסין (TTX) ב- ACSF למשך 10 דקות ולחזור על פרוטוקול הגירוי. אין לצפות בתגובות מעוררות.
- לאחר סיום ניסוי הפרוסה, ודא שהאלקטרודה שמרה על תגובתה על ידי כיול מחדש של האלקטרודה בתמיסות הכיול והבטחה שהתגובה לא סטתה ביותר מ -10% מהכיול הראשוני