$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
הערה: ניתן לבצע הקלטות מ-Q175 wild-type (WT) ומהטרוזיגוטים (HETs) בכל גיל ומין. כאן חקרנו זכרים ונקבות בגיל 51 עד 76 שבועות.
1. הזרקת חיישן הגלוטמט iGluu לביטוי באקסונים קורטיקוסטריאטליים
- השתמש פיפטה מושך (מצב צעד אחד) כדי להכין פיפטות זכוכית בורוסיליקט להזרקת הנגיף. לאחר המשיכה, לשבור את פיפטה באופן ידני כדי לקבל קוטר קצה של 30-50 מיקרומטר. Autoclave פיפטה וכלי ניתוח, כולל מקדחה לפתיחת הגולגולת.
- אחסן את הנגיף AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7.5 x 1013gc/mL) ב -80 ° C ב 10 μL aliquots. אם הזריקות מבוצעות זמן קצר לאחר ייצור הנגיף (תוך 6 חודשים), יש לשמור על טמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס. לפני הניתוח יש להוציא את הבקבוקון ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
- ממלאים את פיפטת הזכוכית ומסירים בועות.
- מרדימים את בעל החיים בהזרקה תוך צפקית של תמיסה המכילה 87.5 מ"ג/ק"ג קטמין ו-12.5 מ"ג/ק"ג קסילזין. תת עורית להזריק 0.25% bupivacain (8 מ"ג / ק"ג) להקלה נוספת בכאב. בדוק את עומק ההרדמה על ידי ניטור טונוס השרירים והתבוננות בהיעדר רפלקסים הנגרמים מכאב.
- לגלח את העור על הראש ולעקר אותו עם 70% אלכוהול. הכנס את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית.
- השתמש באזמל כדי להסיר את העור ובמקדחה במהירות גבוהה (38,000 סל"ד) כדי ליצור חור של 1.2 מ"מ בעצם מעל קליפת המוח המוטורית.
- הר את המזרק עם פיפטת ההזרקה המצורפת במחזיק מניפולטור מדויק. הכניסו פיפטה אנכית לקליפת המוח ב-4 אתרים שונים. קואורדינטות ההזרקה הן, ביחס לברגמה (במ"מ): קדמי 1.5, לטרלי 1.56, 1.8, 2.04, 2.28. העומק ביחס לדורה מאטר הוא (במ"מ): 1.5–1.7.
- באמצעות מערכת ההזרקה, להזריק 0.3 μL לכל אתר של תמיסת וירוס לא מדולל עם מהירות של 0.05 μL / min. לאחר כל הזרקה, השאירו את פיפטה במקומה למשך דקה אחת לפני שתמשכו אותה לאט (1 מ"מ לדקה).
- יש לסיים בסגירת פצע הניתוח בתפר ניילון.
- השאירו את העכבר למשך 0.5 עד שעה על כרית חימום בכלוב נקי לפני החזרתו לכלוב המקורי שלו.
- שמור על העכבר על מחזור יום-לילה של 12 שעות במשך 6 עד 8 שבועות לפני הכנת פרוסות מוח חריפות.
הערה: כדי למנוע תגובות חיסוניות הגורמות לנזק לתאים ולאובדן סינפסות, הזרקה של מבנים נגיפיים מרובים חייבת להתבצע בו זמנית או תוך 2-3 שעות לאחר הזריקה הראשונית. הקואורדינטות להזרקת iGluu נבחרו על פי אטלס המוח של פקסינוס ופרנקלין. הם תואמים את קליפת המוח המוטורית M1. Immunostaining של מוחות מוזרקים דמיינו אקסונים רבים אך בעיקר מבודדים היטב דליות אקסונים בסטריאטום ipsi ו contralateral ובקליפת המוח M1 ו S1 contralateral.
2. חפש מסופים גלוטמטרגיים המבטאים את חיישן הגלוטמט iGluu
- מצב כיול
- הכן את מצלמת sCMOS ואת תוכנת בקרת המצלמה עם ההגדרות הבאות. בדף הקריאה מוגדר קצב קריאת פיקסלים: 560 MHz (= הקריאה המהירה ביותר), רגישות/טווח דינמי: סיביות, מסנן רעש מזויף: כן, חפיפה קריאה: כן. בדף Binning/ROI, בחר מסך מלא.
- הכינו שקופית זכוכית המכילה טיפה של 5 מ"ג/מ"ל לוציפר צהוב (LY) מתחת לכיסוי חלק
.
- מקם את שקופית LY תחת מטרה של 63x, פתח את תריס הלייזר ובצע רכישה טורית באמצעות ההגדרות הבאות: פיקסלים Binning: 1x1, מצב טריגר: פנימי, זמן חשיפה: מינימלי (ייקבע).
- התאימו את עוצמת הלייזר ליצירת כתם פלואורסצנטי בקוטר 4 מיקרומטר (התמונה לא תכיל פיקסלים רוויים).
- כדי לבצע כיול של מערכת מיקום הלייזר, בחר את ההגדרות הבאות בתוכנת מיקום הלייזר: קוטר גודל ספוט: 10, מהירות סריקה: 43.200 קילוהרץ. לחץ על הלחצן Start image acquisition בחלונית הימנית. הגדר הפעלות: 0, השהיית הפעלה: 0 ובחר באפשרות הפעל ב- TTL בדף רצף. לחץ על לחצן כיול בדף כיול וכייל את תוכנת בקרת הלייזר בהתאם להוראות המוצגות בפינה השמאלית העליונה של מסך הרכישה.
- אם ההתקנה משתמשת בתוכנה עצמאית לשליטה במצלמה ובלייזר, רכוש צילומי מסך מחלון רכישת המצלמה ושלח אותם לתוכנת בקרת הלייזר לצורך חישוב מחדש של קואורדינטות XY. אם התוכנה מותקנת במחשבים שונים, השתמש בחוטף וידאו כדי לייבא את התמונה לתוכנת בקרת הלייזר. תוכנת בקרת הלייזר תזדקק למידע על גורמי קנה המידה וההיסט של XY. לשם כך, קבע את הקואורדינטות של הפינה השמאלית העליונה, השמאלית התחתונה והימנית התחתונה של התמונה בחלון הרכישה של תוכנית בקרת הלייזר. חישוב גורמי קנה המידה על פי המשוואות הבאות: X factor = (X למטה מימין – X למטה משמאל)/2048, X היסט = X למטה משמאל, Y factor = (Y למעלה משמאל – Y למטה משמאל)/2048, Y היסט = Y למטה משמאל.
- בסוף הליך הכיול, צור אזור עניין מלבני (ROI) של 267x460 פיקסלים, הזז אותו למרכז המסך ולחץ על לחצן רצף התחל.
- חזור להגדרות תוכנת בקרת המצלמה הבאות: Binning: 2x2, מצב טריגר: חשיפה חיצונית, זמן חשיפה: מינימלי (ייקבע).
- מצב תיקון Autofluorescence
הערה: רמת המנוחה של [Glu] בסביבה של טרמינלים סינפטיים פעילים היא בדרך כלל מתחת ל-100 ננומטר. בהתאם לכך, כל חיישן של גלוטמט, במיוחד חיישן בעל זיקה נמוכה כמו iGluu יהיה עמום למדי בהיעדר שחרור גלוטמט סינפטי. עם זאת, כמה iGluu fluorescence יכול אפילו להיות מזוהה במנוחה, אבל יש להבדיל מן autofluorescence רקמות. הארה של 473 ננומטר מעוררת גם iGluu fluorescence וגם autofluorescence (איור 1A-C). האחרון תופס טווח רחב של אורכי גל, בעוד iGluu fluorescence מוגבל 480-580 ננומטר (עם מקסימום ב 510 ננומטר). התיקון עבור autofluorescence מבוסס על רכישת שתי תמונות עם מסננים שונים מעבר גבוה.
- הכינו מראש פרוסות מוח כמתואר במקום אחר. הכינו את פרוסות הסובין.
- מעבירים את הפרוסות לתוך תא ההקלטה, ושוקעים אותן בנוזל מוחי מלאכותי מחומצן (ACSF) המכיל 125 mM נתרן כלורי (NaCl), 3 mM אשלגן כלורי (KCl), 1.25 mM di מימן נתרן פוספט (NaH2PO4), 25 mM סודיום ביקרבונט (NaHCO3), 2 mM סידן כלורי (CaCl2), 1 mM מגנזיום כלורי (MgCl2), 10 mM גלוקוז (pH 7.3, 303 mOsm/L), בתוספת 0.5 mM נתרן פירובט, 2.8 mM נתרן אסקורבט ו 0.005 mM גלוטתיון. השתמש בקצב זרימה של 1-2 מ"ל/דקה. שמור על טמפרטורת האמבטיה על 28-30 מעלות צלזיוס.
- יש למקם את הסטריאטום הגבי תחת יעד טבילה במים פי 20. תקן את הפרוסות עם רשת ניילון על נבל פלטינה כדי למזער את תנועת הרקמות. עבור ליעד טבילה במים 63x /NA 1.0. בחר מסננים המחזירים אור ב- 473 ננומטר (מראה דיכרואית) ואור מעביר באורכי גל >510 ננומטר (מסנן פליטה).
- סנכרן תאורה, גירוי ורכישת תמונה באמצעות לוח אנלוגי-לדיגיטלי (AD)/דיגיטלי-לאנלוגי (DA) (AD/DA) עם תוכנת הבקרה המתאימה. הגדר את תוכנית הטריגר לשליטה ברכישה עם זמן חשיפה לייזר של 180 אלפיות השנייה וזמן רכישת תמונה של 160 אלפיות השנייה. השתמש במכשיר מיקום הלייזר כדי לשלוח את קרן הלייזר למספר נקודות קבוע מראש ולהגדיר את ההגדרות עבור מהירות סריקה וגודל ספוט.
- קבל תמונה של מבנים אוטופלואורסצנטיים וחיובייםiGlu באמצעות מסנן מעבר גבוה ב- 510 ננומטר ("תמונה צהובה").
- קבל תמונה עם autofluorescence בלבד באמצעות מסנן מעבר גבוה ב- 600 nm ("תמונה אדומה").
- שנה את קנה המידה של התמונות האדומות והצהובות, תוך שימוש בעוצמות הממוצעות של 10 הפיקסלים הבהירים ביותר ו- 10 הכהים ביותר כדי להגדיר את הטווח. בצעו חיסור "תמונה צהובה פחות אדומה" ושינו את קנה המידה של התמונה שהוחסרה כדי ליצור קובץ tif סטנדרטי של 8 סיביות לתצוגה חזותית נוחה של הבטון המעניין (איור 1D). הוא מכיל את הפיקסלים הבהירים ממבניה- u-positive של iGlu, פיקסלים אפורים מהרקע ופיקסלים כהים ממבנים עם autofluorescence.
הערה: עם הציוד הנתון, פלואורסצנטיות המנוחה הממוצעת (F) תהיה מתחת ל-700 A.U.
- מצב חיפוש Bouton
הערה: פיקסלים חיובייםU של iGlu עשויים להשתייך לאלמנטים שונים מבחינה פונקציונלית של עץ האקסונל, כגון ענפי אקסונים מסדר שונה, אתרים של ביפורקציה, דליות לאחר דלדול שלפוחית או דליות פעילות במלואן. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לזהות מסופים סינפטיים פונקציונליים רק על ידי בדיקה חזותית. לכן, כל מסוף סינפטי גלוטמטרגי זקוק לזיהוי על ידי תגובתו לדפולריזציה חשמלית. אתרים שאינם מגיבים לגירוי יש להשליך. האמצעי הפיזיולוגי לגרום לשחרור גלוטמט מאקסונים קורטיקוסטריאטליים הוא לעורר פוטנציאל פעולה. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בערוץ רודופסין בעל מאפיינים ספקטרליים מתאימים או על ידי גירוי חשמלי של אקסון המתואר על ידי iGluu עצמו. כדי למנוע הפעלה מקרית של אופסין, העדפנו את האחרון approastep
- השתמש במושך מיקרופיפטה (במצב ארבעה שלבים) כדי לייצר פיפטות גירוי מנימי זכוכית בורוסיליקט. קוטר החוד הפנימי צריך להיות בערך 1 מיקרומטר. כאשר מלא ACSF, התנגדות האלקטרודה צריכה להיות כ 10 MΩ.
- כדי לגרום לשחרור תלוי פוטנציאל פעולה של גלוטמט מקבוצה של בוטונים סינפטיים המחוברים לאותו אקסון, השתמש בהגדלה של 63x, במסנן הפליטה של 510 ננומטר ובתמונה שהוחסרה כדי למקם אלקטרודת גירוי זכוכית ליד דליות פלואורסצנטיות. הימנע מקרבת אקסונים נוספים.
- הפעל את הממריץ כדי להעביר פולסים של זרם דה-פולריזציה לפיפטת הגירוי. השתמש בעוצמות זרם סביב 2 μA (לא יותר מ 10 μA).
- הפעל את מערכת יישומי האמבטיה הרב-ערוצית שבה ערוץ אחד מספק את פתרון האמבטיה הסטנדרטי והערוצים האחרים מספקים את החוסמים הדרושים של תעלות יונים, טרנספורטרים או קולטני ממברנה. שלוט בזרימה באתר ההקלטה ולאחר מכן עבור לערוץ טטרודוטוקסין (TTX) (תמיסת אמבטיה בתוספת 1 מיקרומטר TTX). אחרי 2-3 דקות, לעורר שוב את הבוטון של עניין, אבל עכשיו בהיעדר פוטנציאל פעולה. השחרור נובע ישירות מזרימת סידן דרך תעלות סידן תלויות מתח.
- על ידי סיבוב מקש העוצמה על המגרה, התאם את זרם הגירוי כדי לקבל תגובות דומות לאלה המתעוררות באמצעות פוטנציאלי פעולה. בדרך כלל, זרם הגירוי יהיה סביב 6 μA עבור דפולריזציה של 0.5 אלפיות השנייה.
- לבדיקה בסיסית של ההכנה, החל 0.5 mM CdCl2. נוכחותו של חוסם תעלות סידן זה שחרור גלוטמט מונע לחלוטין את שחרור הגלוטמט הסינפטי ובכך מאמת את התלות בסידן של אות הגלוטמט המעורר ישירות.
הערה: ההמלצה הכללית הבאה עשויה לעזור להגביר את שיעור ההצלחה של ניסויי סינפסה בודדת בסטריאטום. כדי לבחור הדקים סינפטיים גלוטמטרגיים עם מנגנון שחרור שלם, דליות צריכות: (i) להיות בעלות צורה חלקה דמוית ציר; (ii) לא להיות קשור לפיצול אקסונים; (iii) להיות בהירים יותר ממבנים אחרים ב"תמונה הצהובה"; (4) להתגורר בנוירופיל הסטריאטלי ולא במערכת הסיבים; (v) להתגורר על ענף אקסון דק מאוד; (vi) לא לשכון בחלקים העמוקים יותר של הפרוסה.
3. הדמיה של שחרור ופינוי גלוטמט
- מצב הקלטה
הערה: לאחר החיסור של autofluorescence (שלב 2.2) וכמה בדיקות ראשוניות עבור היענות של bouton של עניין (שלב 2.3), רכישת נתונים יכול להתחיל. את התגובות להפעלה חשמלית של שחרור גלוטמט מהדקי אקסונים בודדים ניתן לראות ישירות בתמונה (איור 2), מבלי להשתמש בכלי ניתוח נוספים. אולם היה נוח מאוד לחלץ מיד כמה אינדיקטורים בסיסיים של ביצועי סינפסות (איור 3). מידע זה נחוץ כדי לקבל החלטות על מהלך הניסוי הבא, כגון בחירה של סוגים טרמינליים מסוימים, הערכה מהירה של שינויים הקשורים HD, מספר ותדירות של ניסויים או תרופות שיש ליישם עם מערכת העירוי. ייתכן שיהיה צורך גם להתמודד עם ממצאים המופיעים בסופו של דבר. ראשית, ההגדרות הסטנדרטיות להקלטת נתונים מתוארות.
- באמצעות כונני XY במיקרוסקופ, מקם את הבוטוןהחיובי iGlu הנבדק קרוב למרכז שדה הראייה. עצור את רכישת התמונה באמצעות לחצן ביטול רכישה. על התמונה האחרונה שנרכשה, לקבוע את המיקום XY של מרכז bouton מנוחה על ידי לחיצה על זה עם כפתור העכבר השמאלי. קואורדינטות XY של הסמן שנקבע יוצגו בלוח המצב התחתון של חלון הרכישה.
- באמצעות נתוני הכיול (שלב 2.1.6), חשב את הקואורדינטות של האתר אליו יש לשלוח את קרן הלייזר לעירור של הפלואורסצנטיותiGlu u. השתמש במשוואות הבאות: X לייזר = X מצלמה * X פקטור + X היסט, לייזר Y = היסט Y - מצלמת Y * גורם Y. בעת ביצוע חישוב מחדש זה, שים לב להגדרות ההיפוך האנכי או האופקי של המצלמה.
- צור רצף של נקודה אחת בתוכנת בקרת הלייזר באמצעות הקואורדינטות המחושבות. למטרה זו, בחר Point בתיבה הוסף לרצף בדף רצף של תוכנת בקרת הלייזר. בחר 10 μs עבור ההשהיה כדי להפעיל את ההתחלה ו- 180 ms עבור זמן פעימת הלייזר. הזז את העכבר לקואורדינטות המחושבות ולחץ על הלחצן השמאלי.
- בחר את ההגדרות הבאות בתוכנת בקרת הלייזר: ריצות: 0, עיכוב הפעלה: 0, רצף: הפעל ב- TTL. לאחר מכן לחץ על התחל רצף.
- בתוכנת בקרת המצלמה, בחר את ההגדרות הבאות: בדף Binning/ROI, הגדר אזור תמונה: מותאם אישית, פיקסלים Binning: 2x2, גובה: 20, רוחב: 20, שמאל: קואורדינטת X של נקודתה-u החיובית iGlu במנוחה מינוס 10 פיקסלים, למטה: קואורדינטת Y של נקודתה-u-positive iGlu במנוחה מינוס 10 פיקסלים, מצב רכישה: סדרה קינטית, אורך הסדרה הקינטית: 400, זמן חשיפה: 0.0003744s (ערך מינימלי). עם הגדרות כאלה, קצב הרכישה יהיה 2.48 קילוהרץ.
- בחר מצב גורם מפעיל: חיצוני. לחץ על קבל אות בתוכנת בקרת המצלמה. הפעל את פרוטוקול הניסוי שנקבע עבור התקן ההדק.
- יישום פרוטוקול הניסוי ניסוי עם ציר הזמן הבא: 0 ms – התחל ניסיון, 1 ms – התחל תאורת לייזר, 20 ms – התחל רכישת תמונה עם מצלמה, 70 ms – התחל גירוי חשמלי 1, 120 – התחל גירוי חשמלי 2, 181 ms – סיום ניסיון (לייזר ומצלמה כבויים). כך, במהלך ניסוי אחד המצלמה רוכשת 400 פריימים בתדר של 2.48 קילוהרץ. ראה שלבים 2.3.3 ו- 2.3.5. לפרטים על גירוי חשמלי.
- כדי לאפשר התאוששות מספקת של בריכות שלפוחית קדם-סינפטיות, החל את פרוטוקול המשפט בתדירות חזרה של 0.1 הרץ ומטה.
- בנייה לא מקוונת של גלוטמט ארעי והערכה מהירה של שחרור גלוטמט וסילוק לזיהוי סינפסות פתולוגיות
- הפעל את שגרות ההערכה. כאן, אנו משתמשים בתוכנה כתובה פנימית SynBout v. 3.2. (מחבר: אנטון דבוז'אק). השלבים הבאים נדרשים כדי לבנות ארעי ΔF/F מהפיקסלים עם פלואורסצנטיות iGluu מוגברת כמו בסרטון של איור 2.
- כדי לקבוע את גודל הבוטון, חשב את הממוצע וסטיית התקן (SD) של עוצמת הפלואורסצנטיות של החזר ההשקעה במנוחה (F), לפני תחילת הגירוי. קבעו וארזו את האזור שנכבש על-ידי פיקסלים עם F>mean + 3 SD (איור 3A). קבע קוטר וירטואלי (במיקרומטר) בהנחה של צורה מעגלית של שטח הסף העליון.
- קבעו את ΔF כהפרש בין ערך עוצמת השיא לבין F. התוו את הזרם המגרה ואת ΔF/F כנגד הזמן (איור 3B). חשב את SD של ΔF/F במנוחה (לפני תחילת הגירוי) ואת "משרעת שיא". השתמש בפיקסל עם משרעת שיא של יותר מ-3 SD של ΔF/F כדי לבצע התאמה מונו-מעריכית לדעיכה מהשיא. קבע את קבוע הזמן של דעיכה TauD של ΔF/F.
- כדי להעריך את "המשרעת המרבית" בסינפסה נתונה, בחר בפיקסל עם ערך ΔF/F הגבוה ביותר. הוא ממוקם בדרך כלל בתוך או ליד גבולות המנוחה iGluu fluorescence. "המשרעת המקסימלית" תהיה האינדיקטור הטוב ביותר לעומס הגלוטמט המוצג למכונות הסילוק של סינפסה יחידה.
