In Vivo רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילויות מוחיות מאתרים מרובים בחולדות

תקציר

מקור: Haumesser, J. K., et al. Acute In Vivo הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאלי שדה מקומיים ופעילות רב-יחידתית מהמסלול ההיפר-ישיר בחולדות מורדמות. J. Vis. Exp.(2017).

סרטון זה מדגים את ההליך המפורט להכנת חולדה מורדמת להקלטות אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מוחית מאתרים מרובים. הקרקפת מנותחת כדי לגשת לגולגולת, וחורים נקדחים במקומות מדויקים כדי להתקין ולאבטח אלקטרודות. אלקטרודות מיקרו-חוט טונגסטן מוכנסות לאחר מכן למיקום היעד כדי להקליט את הנתונים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. כירורגיה

1. לרישומים אלקטרופיזיולוגיים, יש להשתמש באורתן (CAUTION) להרדמה.
   זהירות: אורתאן הוא רעיל ומסרטן, ולכן יש להקפיד תמיד על תקנות הבטיחות ודף הנתונים שניתן על ידי יצרן החומר.
2. הכינו תמיסה של 200 מ"ג/מ"ל אורתן בתמיסת מלח רפואית 0.9% נתרן כלורי (NaCl).
3. יש לתת אורתן תוך צפקי במשקל גוף כולל של 1.3 גרם/ק"ג. בהתאם לזן החולדה, ייתכן שיהיה סביר לפצל את המינון לשתי מנות עם מרווח של 15 דקות בין הזריקות על מנת לשפר את בטיחות ההרדמה.
4. בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגה מדוושה ורפלקסים מתאימים אחרים. אם ההרדמה אינה עמוקה מספיק לביצוע ניתוח, יש להזריק 0.15 גרם/ק"ג משקל גוף של אורתן IP ולהמתין 15 דקות נוספות.
5. החל משחת עיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית.
6. עקוב כל הזמן אחר קצב הנשימה ורפלקס גמילה מדוושה במהלך ההרדמה. השתמש בכרית חימום קטנה של בעלי חיים עם בקרת טמפרטורה כדי להבטיח שמירה על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית לאורך כל הניתוח. לפני תחילת הרישומים האלקטרופיזיולוגיים, יש לעבור לחלופה לא חשמלית (למשל כרית ראש נתרן אצטט).
7. יש לגלח את הפרווה לצד הגבי של הראש כדי להשיג שדה ניתוחי נקי. יש לחטא סביב אזור החתך בחומר חיטוי כירורגי מתאים. תקן את החיה במסגרת הסטריאוטקטית.
8. בצע חתך באורך 2 ס"מ של הקרקפת בכיוון קשת עם אזמל. השתמש אזמל כדי לגרד מעט את aponeurosis הגולגולת ולחטא את הגולגולת. השתמשו בניצני כותנה ספוגים במי חמצן 3% (H₂O₂) כדי להסיר את הרקמה שנותרה.
9. השתמש electrocauter או thermocater כדי לשלוט בדימום, במידת הצורך. להפסיק דימומים מעצם הגולגולת והיפודרם, אם הדימום אינו מפסיק באופן ספונטני לאחר 1-2 דקות ומפריע לראייה על הגולגולת.
10. כוונן את המוט החותך עד שהראש ממוקם במצב גולגולת שטוח, כלומר הברגמה והלמבדה כנקודות ייחוס סטריאוטקסיות נמצאות באותו מישור. זה הכי חשוב כדי להשיג דיוק כירורגי גבוה. השתמש בכלי יישור חולדות סטריאוטקסי סטנדרטי, כייל את הקצה המיועד לברגמה תחת ראייה מיקרוסקופית וכוונן את הסרגל החותך עד שהנקודות המיועדות לברגמה ולמבדה בכלי נוגעות בגולגולת בו זמנית.
    הערה: מבט מצד אחד עם אור ממוקד מצד שני עשוי לעזור לקבוע מצב זה. לחלופין, קחו מחזיק סטריאוטקסי עם צינורית עדינה ומדדו את הקואורדינטות הדורסו-ונטרליות של ברגמה ולמבדה תחת ראייה מיקרוסקופית. כוונן את הסרגל החותך עד שהקואורדינטות הדורסו-ונטרליות של ברגמה ולמבדה זהות.
11. השתמש מחזיק סטריאוטקסי עם צינורית, לכייל לברגמה, ולאחר מכן לחשב את המיקום של כל חורי הקידוח על הגולגולת. באמצעות המחזיק הסטריאוטקסי, סמן את מיקומי החורים שיש לקדוח על ידי גירוד זהיר של הגולגולת או באמצעות סמן צבע כירורגי. הקואורדינטות לכך תלויות במטרות; קואורדינטות עם התייחסות לברגמה ניתנות עבור המסלול ההיפר-ישיר בטבלה 1, כולל הקואורדינטות המוצעות עבור אלקטרודות ייחוס צרבלריות.
12. באמצעות מקדחה מיקרו, בזהירות לקדוח את כל החורים. עבור הגרעין התת-תלמי (STN) והחומר התת-תלמי pars reticulate (SNr), קדח חור משותף (בגודל של כ-2 מ"מ x 3 מ"מ). כל חורי הקידוח האחרים צריכים להיות בקוטר של כ -1 מ"מ.
13. קחו שתי צינוריות עדינות (לפחות 27 גרם) וכופפו את קצותיהן ליצירת צורה מחוברת, בעזרת משטח קשיח או פינצטה. השתמש בהם כדי להסיר לכלוך מחורי הקידוח, וחתוך בזהירות והסר את הדורה מאטר בחור STN/SNr המשותף.
14. שטפו את חורי הקידוח במי מלח פיזיולוגיים. מרחו טיפת מלח פיזיולוגית כל 15 דקות על חורי הקידוח כדי למנוע מהמוח ומהדורה להתייבש.
15. קח מיקרו-מקדח ומיקרו-בורג נירוסטה תואם (למשל בורג M 1.2 מ"מ x 2 מ"מ), קדח חור והברג במיקרו-בורג בין חורי הקידוח של אלקטרודות הייחוס האפידורליות מעל המוח הקטן, עשה את אותו הדבר עבור אלקטרודות אפידורליות M1.
16. החלק את האלקטרודות האפידורליות Ag/AgCl שנבנו בעצמן לתוך חורי הקידוח עבור אלקטרודות הייחוס ואלקטרודות M1. יש להנחות את קצה האלקטרודה בעזרת פינצטה עדינה ולהחליק אותה ישירות מתחת לעצם הגולגולת לתוך חור הקידוח.
17. תקן את כל אלקטרודות האפידורל עם אקריליק דנטלי דו-רכיבי. הקפד לא לכסות את נקודת bregma ולא להשפיע על חור STN/SNr הנפוץ.
18. הכנס את המחזיק המוכן עם אלקטרודות microwire טונגסטן לתוך מסגרת סטריאוטקסית.
19. כיילו את האלקטרודה הגחונית ביותר, המיועדת לכוון את STN, לברגמה. התאימו את עצמכם למיקום המחושב מעל חור STN/SNr המשותף והורידו את האלקטרודות מטה למוח תחת ראייה מיקרוסקופית. ודא כי אלקטרודות טונגסטן microwire להיכנס לתוך המוח בצורה חלקה.

2. מיפוי והקלטות אלקטרופיזיולוגיות

הערה: לצורך שלב זה יש צורך בכלוב פאראדיי ובמערכת הקלטה אלקטרופיזיולוגית רב-ערוצית עם תוכנת הקלטה המסוגלת לבצע סינון מקוון ומיון דוקרנים מקוון. רצוי להשתמש במערכת שעובדת עם קדם-מגבר הממוקם ליד ראש החיות כדי לשמור על רעש חשמלי וחפצים למינימום האפשרי. מלבד אלקטרודות המיקרו-חוט של טונגסטן, יש צורך לפחות באלקטרודת אפידורל אחת ובאלקטרודת ייחוס אחת כדי לבצע הקלטות של מסלול ההיפר-ישיר. מומלץ להחדיר אלקטרודות אפידורליות ואלקטרודות ייחוס בזוג מבלי שהן ייגעו זו בזו, זה עוזר במקרה של תקלה ומאפשר סוגים שונים של התייחסות בניתוח נתונים.

1. שים כלוב פאראדיי נייד מעל המסגרת הסטריאוטקסית. אם רק כלוב פאראדיי נייח זמין, העבירו בזהירות את המסגרת הסטריאוטקסית לתוך כלוב פאראדיי תוך כדי שאתם מוודאים שאלקטרודות מוח עמוקות אינן יורדות לתוך המוח עד שהמסגרת הסטריאוטקסית נמצאת במקומה הסופי.
2. חבר את האלקטרודות לראש המערך האלקטרופיזיולוגי. ודא שאלקטרודות הייחוס מחוברות לתעלות ייחוס מתאימות.
3. הגדר את תוכנת ההקלטה: מסנן Bandpass (0.05-8,000 הרץ) והגבר (רווח פי 1,500-2,000) את אות הנתונים הגולמי. השתמש במסנן LFP וספייק מקוון עם הגדרות מתאימות (מסנן פסים 0.05-250 הרץ עבור LFPs, מסנן פסים 300-8,000 הרץ עבור MUA). עבור כל המסננים, השתמש במסנן מסוג butterworth.
4. הגדר סף ספייק, אם רלוונטי, למיון דוקרנים מקוון. רוב תוכנות ההקלטה מאפשרות הגדרת סף ספייק, שהוא ערך משרעת שמעליו אות מסומן כספייק על ידי התוכנה. סף זה יכול להיקבע מתמטית כגורם או סטיית תקן של המשרעת הממוצעת של אות הספייק המסונן, או עדיף להיקבע על ידי בדיקה חזותית של מקטעי נתונים <500 אלפיות השנייה ולהגדיר אותו כקו מעל רעש האות בממשק משתמש גרפי.
   הערה: הכוונה בקביעת סף ספייק היא לספור קוצים ולמיין יחידות כדי לספק מידע על כמה תאי עצב נרשמים כיום וכיצד קוצים שלהם מעוצבים.
5. הורידו לאט לאט את אלקטרודות המיקרו-חוט של טונגסטן לגובה של 1 מ"מ של המטרה, שהוא STN עבור מסלול היפר-ישיר. המתן עד שהאות יתייצב במידת הצורך.
6. לצורך המיפוי האלקטרופיזיולוגי, מקדמים את האלקטרודות באופן גחוני בצעדים של 100 מיקרומטר. בכל שלב, העריכו את דפוס הירי, קצב הירי וצורת הדוקרנים. השוו את אלה עם הדוגמאות האופייניות שניתנו באיור 1. בדרך כלל, גרעינים צפופים מראים זינוק מהיר ומתמשך על פני מספר צעדים דורסו-ונטרליים, בעוד שמבנים עשירים בסיבים מראים קצבי ירי נמוכים ופעילות ספייק הומוגנית פחות בצעדים הגחונים הבאים.
7. עבור מסלול היפר-ישיר, ודא שהאלקטרודה הגחונית ביותר נמצאת בתוך STN.
   הערה: STN הוא הגיע כאשר עלייה ניכרת MUA מזוהה הגחון של Zona incerta. גחון ל STN, קוצים מפסיקים כמעט לחלוטין כי האלקטרודה הגיעה לקפסולה הפנימית. כאשר האלקטרודה הגחונית ביותר נמצאת ב-STN, התצורה של מיקרואלקטרודות הטונגסטן מבטיחה שהאלקטרודה האחורית, השנייה, תהיה ב-SNr. ייתכן שיהיה צורך בכוונון עדין דורסו-ונטרלי במרווחים קטנים כדי להקליט MUA טיפוסי ב-STN וב-SNr בו זמנית. שימו לב שתדירות MUA תלויה במספר תאי העצב שנרשמו בפועל וברמת הפעלת המוח.
8. ברגע שהאלקטרודות נמצאות במבנים הרצויים, הגדירו סינון מקוון ומיון ספייקים (ראו איור 2), ואז התחילו להקליט את הנתונים. דוגמאות אופייניות למצבי סנכרון קליפת המוח השונים שניתן לזהות ברישומי LFP מוצגות באיור 3.

טבלה 1: קואורדינטות סטריאוטקסיות להקלטה של מסלול הגנגליה הקורטיקו-בזאלית ההיפר-ישירה. כל הנקודות נמדדות מנקודת הייחוס ברגמה על הגולגולת במ"מ; נ.א. - לא ישים.

קואורדינטות מברגמה	STN	SNr	M1	הפניה 1	הפניה 2
קדמי-אחורי	-3.6	-4.8	+3.0	-10.0	-10.0
מדיאלי-לטרלי	+2.5	+2.5	+3.0	+3.0	-3.0
גב-גחון	-8.0	נ. א.	נ. א.	נ. א.	נ. א.

תוצאות

איור 1: פעילות רב-יחידתית אופיינית ממסלול אלקטרודות דורסו-ונטרלי המכוון ל-STN. (A) רישומים מרובי יחידות של הגרעין התלמי הפוסט-מדיאלי הגחוני (VPM), הזונה אינסרטה (ZI), הגרעין התת-תלמי (STN) והחומר השחור pars reticularis (SNr). ה- VPM מציג קוצים דלילים ומרווחים באופן לא סדיר באמפליטודה גבוהה. דפוס זה של קוצים נפסק כאשר מתקרבים ל- ZI. כאשר האלקטרודה נכנסת ל-STN ניתן להבחין בדפוס ירי טיפוסי בתדר גבוה עם ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלקטרודות אפידורליות מותאמות אישית Ag/AgCl	Goodfellow GmbH D-61213 באד נאוהיים, גרמניה info@goodfellow.com	מזהה מוצר AG005127 עבור חוט כסף 99.99%	אלקטרודות Ag/AgCl יאפשרו איכות אות טובה יותר, אך ניתן להשתמש בהן רק בניסויים חריפים. החלפה אפשרית: אלקטרודות נירוסטה
מחזיק סטריאוטקסי עם בלוק אקרילי	David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, ארה"ב	מזהה מוצר דגם 1770 מחזיק אלקטרודות סטנדרטי	יש לוודא שלבלוק האקרילי יש גומחות המתאימות למערך האלקטרודות למטרה הרצויה. בלוקים אקריליים ניתן לשנות בקלות עם קובץ כדי לקבל את התצורה הרצויה. החלפה אפשרית: מחזיקי אלקטרודות בבנייה עצמית
אלקטרודות מיקרו-חוט טונגסטן 1.5 MΩ עכבה	Microprobes.com 18247-D דרך פלאוור היל גייטרסבורג, מרילנד, 20879 ארה"ב	מזהה מוצר: WE3ST31.5A5-250um	1.5 MΩ יש צורך להקליט MUA ו- LFP בו זמנית. החלפה אפשרית: ניתן להשתמש במיקרואלקטרודות מחומרים שונים. האלקטרודות צריכות להיות ישרות, חזקות ודקות ככל האפשר.
כלי יישור חולדות	David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, ארה"ב	מזהה מוצר: דגם 944 כלי יישור חולדות	מאפשר את הכיוון המדויק של המוח כדי להתאים אטלסים סטריאוטקסיים. החלפה אפשרית: מחזיק סטריאוטקסי עם צינורית
אקריליק דנטלי דו-רכיבי	Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, בריטניה	אבקה מהירה חד-צדדית שקופה 225 גרם, קוד מוצר: ACR803; נוזל מהיר סימפלקס 150 מ"ל, קוד מוצר: ACR920	בהתאם לאלקטרודות בהן נעשה שימוש, דבק-על עשוי להיות חלופה קלה, אם האלקטרודות קטנות וקלות משקל. תחליף אפשרי: דבק-על (על בסיס ציאנקרילט)
כלוב פאראדיי	בנייה עצמית		כלוב פאראדיי ראוי יהיה ההגנה הטובה ביותר מפני ממצאים אלקטרומגנטיים, אבל כל מה שניתן ליצור בצורת קופסה או להחיל על מסגרת ועשוי מחומר מוליך עשוי לעזור. החלפה אפשרית: רדיד אלומיניום או רשת נחושת
מערך אלקטרופיזיולוגי עם תוכנת הקלטה ויכולות מיון דוקרנים מקוונות	OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, סוויטה 700<של/> דאלאס, טקסס 75206 ארצות הברית		תוכנת מיון לא מקוונת היא חלופה פוטנציאלית, סקריפטים ותוכנות מרובים ניתן למצוא בחינם בקהילת הקוד הפתוח.