הקלטה אופטית של פעילות עצבית בפרוסות מוח מוכתמות בצבע רגיש למתח

תקציר

מקור: Tominaga, Y., et al. הקלטה אופטית של פוטון יחיד בשדה רחב בפרוסות מוח באמצעות צבע רגיש למתח. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים הליך לצפייה בשינויים בפעילות העצבית בפרוסת מוח המוכתמת בצבע רגיש למתח. הצבע משקף שינויים בפוטנציאל הממברנה של תא העצב על ידי שינוי עוצמת הפלואורסצנטיות שלו. באמצעות יישום גירויים חשמליים וטכניקות הדמיה מתקדמות, תהליך זה מאפשר מעקב חזותי אחר שינויים בזמן אמת בפוטנציאל הממברנה העצבית בהתבסס על פלואורסצנטיות VSD.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנה יומית של מנגנון ניסיוני

1. הפעל את המגבר, המחשב ומערכת המצלמה ובדוק שהתוכנה פועלת.
2. מניחים נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) בצינור 50 מ"ל ובועות עם קרבוגן.
3. השתמש במשאבה פריסטלטית כדי להפיץ את ACSF. כוונן את קצב הזרימה לכ-1 מ"ל/דקה.
4. התאם את גובה פיפטת היניקה כך שרמת הנוזל בתוך תא הניסוי תהיה תמיד קבועה.
   הערה: רמת הפתרון חשובה כדי להשיג הקלטה יציבה, ולכן, ההתאמה צריכה להיעשות באמצעות micromanipulator.
5. התקן את אלקטרודת הארקה המורכבת משבב צהוב מלא באגר KCl 3 M (2%) לתוך מחזיק עם חוט Ag-AgCl עם כמות קטנה של תמיסת 3 M KCl.
6. ממלאים כמות קטנה של ACSF (כשני שליש מהנפח) לתוך אלקטרודת הזכוכית (קוטר חיצוני של 1 מ"מ, קוטר פנימי של 0.78 מ"מ הנמשך באמצעות מושך מיקרופיפטה) באמצעות קצה צהוב מחודד בעל צינור דק ומניחים אותו במחזיק האלקטרודות.
7. חבר את המחזיק למוט המותקן במניפולטור. ודא באמצעות מגבר כי התנגדות האלקטרודה היא בערך 1 MΩ.
   הערה: האלקטרודה מסוג תיקון מסוג פתח רחב ארוך שוק (פתח 4-8 מיקרומטר) צריכה להיות טובה להקלטת שדה וכאלקטרודה מעוררת.

2. התחלת סשן הקלטה

1. קח פרוסה הכנה מן החדר לח עם מלקחיים.
2. הניחו במהירות את הפרוסה על תא ניסוי מתחת למיקרוסקופ (איור 1).
3. דחפו את קצה הטבעת בחוזקה לתוך טבעת ה-O מסיליקון. היזהר לא לשבור את הממברנה או את החלק התחתון של תא הניסוי.
   הערה: יש לקחת בחשבון את כיוון הפרוסה ביחס לכיוון האלקטרודות המעוררות והמקליטות בשדה הראייה. הפרוסה הבריאה צריכה להידבק לפילטר הממברנה כך שאין צורך להשתמש במכשירים אחרים כדי לתקן את הפרוסות כגון משקולות ורשתות ניילון.
4. הניחו את קצה האלקטרודה המגרה ואת אלקטרודת ההקלטה הפוטנציאלית של השדה על הפרוסה מתחת למיקרוסקופ עם האור המועבר.
5. השתמש במערכת ההקלטה האלקטרופיזיולוגית כדי לבדוק את התגובה. אשר את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית הרגילה (שאינה מוכתמת) עם תצורה נתונה.
   הערה: ניתן להשמיט את אלקטרודת ההקלטה אך היא שימושית לבדיקת הפיזיולוגיה של הפרוסה.
6. כוונן את עוצמת אור העירור לכ- 70-80% מהקיבולת המרבית במצלמה המתאימה ל- 13-15 mW/cm² בדגימה בעת דגימה ב- 10 kHz עם עדשת מטרה טבילת מים 5x ועדשת צינור 1x PLAN APO. אורך גל אור העירור הוא 530 ננומטר, ומסנן הפליטה חייב להיות > 590 ננומטר.
   הערה: השתמשו בתריס כדי למזער את כמות האור המעורר. חשיפה מתמשכת לאור עלולה לדרדר את הפיזיולוגיה של הפרוסה. ההשפעה המזיקה האפשרית של האור תלויה בעוצמת האור ובמשכו. השתמש בהקלטה אלקטרופיזיולוגית כדי לשפוט את השפעת האור. במקרה של חוזק של 13-15 mW / cm², חשיפה של כ -1 s צריכה להיות הגבול העליון של הסבילות.
7. התאם את המיקוד עם מערכת הרכישה באמצעות מקור האור הפלואורסצנטי מכיוון שהמיקוד עשוי להיות שונה בהתאם לאורך הגל והתחל את הרכישה.
8. בדוק את הנתונים בתוכנה לרכישת תמונות.
   הערה: השתמשנו בחבילת מיקרו-תכנות מקורית של תוכנת ניתוח נומרי לניתוח מפורט.

תוצאות

איור 1. מערכת הקלטה לאותות אופטיים מתכשירי פרוסות. (A) תצלום של המיקרוסקופ המשמש לצילום הפרוסות בכתב היד הנוכחי. האופטיקה מורכבת מעדשה אובייקטיבית (5x NA0.60), קופסת מראה למסנן דיכרואי (580 ננומטר) ועדשת הקרנה (צינור) (PLAN APO x1.0). מצלמה במהירות גבוהה מחוברת בחלק העליון של עדשת ההקרנה באמצעות תושבת C. יש עוד מצלמת USB רגילה לתצפית. אור עירור מוצג באמצעות סיבים אופטיים. (ב)...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערכת לרכישת תמונה במהירות גבוהה	Brainvision ושות' בע מ	מיקאם - אולטימה	מערכת הדמיה
מערכת לרכישת תמונה במהירות גבוהה	Brainvision ושות' בע מ	מיקאם 02	מערכת הדמיה
Macroscepe להדמיית שדה רחב	Brainvision ושות' בע מ	מקרוסקופ THT	מקרוסקופ
מערכת תאורת LED בעלת poare גבוה עם סטבלילייזר פוטו-דיודודי	Brainvision ושות' בע מ	LEX-2G	תאורת לד
תוכנה לרכישת תמונות	Brainvision ושות' בע מ	כ"ד-אנה	תוכנה לרכישת תמונות
ממריץ חשמלי רב תכליתי	Brainvision ושות' בע מ	ESTM-8	מבודד גירוי + ממיר AD/DA
מסנן ממברנה לתמיכה בפרוסה	מרק מיליפור בע"מ, מסצ'וסטס, ארה"ב	Omnipore, JHWP01300, נקבוביות 0.45 מיקרומטר,	מסנן ממברנה/ 0.45 13
תוכנה לניתוח נומרי	Wavemetrics Inc., אורגון, ארה"ב (ארצות הברית)	איגורפרו	תוכנת ניתוח
מבודד גירוי	WPI בע"מ	A395	מבודד גירוי
ממיר AD/DA	אינסטרוטק	ITC-18	ממיר AD/DA
צבע רגיש למתח Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	מק"ט: D-1199	VSD: Di-4-ANEPPS
שמן קיק פוליאתוקסילט	סיגמא-אולדריץ'	קרמופור EL C5135	שמן קיק פוליאתוקסילט