כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בעלי חיים
- השתמש בעכברים מהונדסים גנטית OR-IRES-tauGFP (OR = קולטן חוש הריח, IRES = אתר כניסה פנימי של ריבוזום, tauGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק טאו) הזמינים במעבדת ג'קסון. עכברים אלה פותחו במעבדתו של ד"ר פיטר מומבארטס במטרה לנתח מיקוד אקסונים ופיתוח מערכת חוש הריח. לדוגמה, קו MOR23-IRES-tauGFP, מספר מניה 006643, נושא את שם הזן הרשמי B6; 129P2-Olfr16tm2Mom/MomJ; באופן דומה, קו SR1-IRES-tauGFP, מספר מניה 6717 נושא את השם הרשמי B6; 129P2-Olfr124tm1Mom/MomJ.
- לגבי גיל בעלי החיים: לקבלת תוצאה טובה יותר של הפרוטוקול, השתמש בבעלי חיים בין 2 ל 4 שבועות של גיל. בקבוצת גיל זו, הדיסקציה קלה יותר (עצמות רכות יותר, אפיתל ריח מוצק יותר) והידיות הדנדריטיות גדולות יותר בהשוואה לבעלי חיים מבוגרים.
2. הכנת אלקטרודות ותמיסות
- עבור פיפטות מגרה: לרכוש פיפטות מגרה מראש משוך. אחרת, להכין אותם באופן ידני.
- בעזרת להבה, כופפו שש פיפטות זכוכית בקוטר 1 מ"מ במרחק של כ-1 ס"מ מהקצה. הכניסו את שש הפיפטות הללו בתוספת צינור ישר 7 אינץ' באורך 1.5 ס"מ המתכווץ בחום המחוזק על ידי איילת.
- החום מכווץ את הצינור כדי לשמור על החביות המחוברות זו לזו. חברו צינור כיווץ חום נוסף לקצה השני של החביות. משוך פיפטה מגרה זו עם מושך רב חבית.
- הוסיפו מעט דבק נוזלי לבן סביב האיילט כדי לחזק את הקצוות המכופפים. הניחו לו להתייבש למשך הלילה (O/N).
- הכינו 1 או 2 ליטר של תמיסה חוץ-תאית רגילה של רינגר (ב-mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, גלוקוז 15; pH 7.6 ו-305 mOsm). יש לשמור על טמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
- הכינו תמיסת ציר תוך-תאית (ב-mM): KCl 70, KOH 53, חומצה מתאן-סולפונית 30, אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA) 5, 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאן-חומצה סולפונית (HEPES) 10, סוכרוז 70; pH 7.2 (KOH) ו-310 mOsm. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C עד לשימוש. טוב למספר שבועות.
- הכינו תמיסת הקלטה תוך תאית עם ניסטטין באופן זמני (ברגע האחרון) לפני הניסוי.
- שקלו 3 מ"ג של ניסטטין, הוסיפו 50 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO); מערבולות 20 שניות ואז סוניקו 2-3 דקות עד לדילול מלא.
- הוסף 20 μl של תמיסת DMSO-nystatin ב 5 מ"ל של תמיסת מלאי תאית. מערבולת 20 שניות, ואז סוניקציה 3 דקות. שמור על תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C והגן מפני אור ישיר, ניסטטין רגיש לאור. פתרון זה יכול לשמש במשך כמה שעות. יש להחליף כל יום.
- ברגע הכנת אפיתל הריח הוא מתחת למיקרוסקופ, לקחת חלק פתרון זה מזרק 1 מ"ל עם קצה צהוב מוארך להבה כדי למלא את האלקטרודות; להגן מפני אור ישיר. פעם אחת בטמפרטורת החדר (RT), פתרון nystatin אינו יציב; החלף את הפתרון מזרק 1 מ"ל כל שעה או לשמור אותו בקרח.
- משוך אלקטרודות הקלטה עם מושך כדי להשיג צוואר ארוך וקצה קטן (~ 2 מיקרומטר) עם התנגדות של 15-20 MΩ עם תמיסת הניסטטין הפנימית.
- הכינו תמיסת ריח בטמפרטורה של 0.5 מ' ב-DMSO מתחת למכסה האדים; יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. מדללים את הריח בתמיסת רינגר עד לריכוז הרצוי. ממלאים את הפיפטה המעוררת.
3. הכנת אפיתל הריח
הערה: עכברי OR-IRES-tauGFP מבטאים את tauGFP תחת שליטתו של מקדם OR. בעכברים אלה, כל תאי העצב המבטאים את ה-OR של העניין מסומנים ב-GFP. פרוטוקול זה מותאם ל-ORs המבוטאים בכל האזורים. עם זאת, דיסקציות והקלטות קלות יותר עבור ORs המבוטאים באזור הגב.
- מרדימים את בעל החיים על ידי הזרקת תערובת של קטמין וקסילזין (150 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף, בהתאמה). עריפת ראשים יכולה להתבצע עם מספריים חדים לעכברים צעירים או עם גיליוטינה מכרסם מתוחזקת כראוי לעכברים מבוגרים.
- באמצעות מספריים לניתוח טבעת לבצע חתך מדיאלי אורכי דרך העור הגבי. הסר את העור על ידי משיכתו. בעזרת המספריים חותכים את הלסתות התחתונות במפרק הלסת. הסר את השיניים הקדמיות העליונות על ידי חתך קורונלי מקביל לשיניים.
- בצע חתך קורונלי של הראש מאחורי העיניים ולשמור רק את החלק הקדמי של הראש. טבלו אותו בתמיסת רינגר קרה כקרח לדיסקציה מתחת להיקף.
- חתכו מתחת להיקף: בצד הגחוני בצעו חתך אורכי לאורך הלסת העליונה/השיניים. חותכים את עצמות הגב לאורך, בעקבות הצד הגבי של חלל האף. הסר את רוב העצמות והחיך; מעבירים את המחיצה ואת האפיתל המחובר אליה בצלצול מחומצן ב-RT.
- לדיסקציה הסופית: ממש לפני תחילת ההקלטה, קלפו את האפיתל מהמחיצה הבסיסית בעזרת מלקחיים. נתקו את האפיתל בעזרת מלקחיים ובעזרת שני חתכי מספריים בקוטר 4-5 מ"מ (השתמשו במספריים מיקרו-ואנה) בחלק הקדמי של המחיצה שם ההדבקה חזקה יותר.
- בזהירות להסיר את איבר vomeronasal על ידי חיתוך אותו לאורך החיבור הגבי שלה אפיתל מחיצה. להעביר את האפיתל לתא הקלטה עם שכבת ריר פונה כלפי מעלה; שמור אותו שטוח בחדר עם נבל.
- התקן תא תחת מיקרוסקופ זקוף המצויד באופטיקה פלואורסצנטית ובמצלמה רגישה. דמיינו את ההכנה על מסך המחשב בהגדלה גבוהה באמצעות יעד טבילה במים פי 40 (צמצם מספרי 0.8) והגדלה נוספת פי 2 או פי 4 המושגת על ידי עדשה מגדלת. יש לערבב ברציפות עם רינגר מחומצן ב-RT (1-2 מ"ל/דקה).
4. סשן הקלטה
- חפש תאים פלואורסצנטיים: לעורר את ההכנה ב 480 ננומטר עבור EGFP, אשר פולט אור בטווח 530-550 ננומטר; לכוון ידית דנדריטית אחת אשר נראה אמין פלואורסצנטי תחת שדה בהיר.
- מלא את האלקטרודה בתמיסה תוך תאית עם ניסטטין; הסר בועות על ידי הקשה עדינה על האלקטרודה.
- הכנס אלקטרודה על מחזיק האלקטרודה, להפעיל לחץ חיובי בפיפטה; ההתנגדות צריכה להיות 15-20 MΩ.
- קרבו אלקטרודה לתא; ברגע שההתנגדות מגיעה ל~40 MΩ, שחררו לחץ חיובי והפעילו לחץ שלילי קל כדי להגיע לג'יגזיאל.
- לאחר שהאטם הגיע, הגדר את פוטנציאל הממברנה על -75 mV;
- לאחר פתיחת התא, להמשיך עם פרוטוקולי גירוי, טיפולים תרופתיים. כדי למדוד את התגובה לגירוי ריחני יחיד, רשום 200-500 msec של פעילות ספונטנית, עורר במשך 500 msec ומדוד את תגובת התא עד 10 שניות. עבור טיפולים תרופתיים, לערבב את החומרים הפרמקולוגיים בריכוז הרצוי.
