רישום פעילות עצבית בעכברים הנעים בחופשיות באמצעות פוטומטריית סיבים

תקציר

מקור: Martianova, E., et al. פוטומטריה מרובת סיבים לתיעוד פעילות עצבית בבעלי חיים הנעים בחופשיות. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים שיטה לרישום פעילות עצבית בעכבר הנע בחופשיות באמצעות פוטומטריית סיבים. בשיטה זו, נוירונים באזור מסוים במוח מבטאים אינדיקטור סידן מקודד גנטית. גירוי מוחל על אזור מוח זה, והשינוי תלוי הגירוי בפלואורסצנטיות נמדד כדי לזהות פעילות עצבית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. יישור הנתיב האופטי בין מצלמת CMOS (מוליך למחצה תחמוצת מתכת משלימה) לבין כבל תיקון בודד או מסתעף

1. שחררו את כל הברגים במתרגם בעל 5 הצירים (איור 1B).
2. הברג את כבל התיקון (איור 1B) למתאם [SMA (תת-זעיר A) או FC (מחבר סיב אופטי)] המודבק למתרגם בעל 5 הצירים.
3. הפעילו את נורת העירור של 470 ננומטר (איור 1B) בהספק נמוך (100 מיקרו-ואט) והניחו את קצה כבל התיקון המצביע על שקופית פלסטיק אוטופלואורסצנטית. אין לכך כל השפעה על הקלטות עתידיות אלא אך ורק להמחשת תהליך היישור.
4. הקלט ממצלמת CMOS (איור 1B) במצב חי. הגדל את הרווח או התאם את טבלת בדיקת המידע (LUT) עד שהתמונה לא תהיה שחורה לחלוטין. המטרה היא להיות מסוגלים לראות תמונה בנקודת המוקד של המטרה (איור 1B).
5. קדם את המתרגם בעל 5 הצירים לעבר המטרה, וודא שאור 470 ננומטר ממורכז בסיב בקצה SMA או FC של כבל התיקון עד שניתן יהיה לפתור תמונה במצלמה.
6. התאימו את צירי X ו- Y עד שהתמונה ממורכזת ונפתרת היטב.
7. דמיינו את האור הנפלט מקצה הפרול של כבל התיקון. זה צריך להופיע כמעגל איזוטרופי. אם נעשה שימוש בכבל טלאי מסתעף, כמות האור הנפלטת בקצוות הפרול של כל כבל טלאי צריכה להיות דומה. אם המעגל אינו איזוטרופי או שהאור הנפלט אינו שווה, התאימו את המתרגם בעל 5 הצירים בציר X-Y.

2. הגדרת ROI סביב סיבים למדידת עוצמה פלואורסצנטית ממוצעת

1. הדליקו את כל נורות העירור כדי לדמיין טוב יותר את הסיבים. כוונן את רווח המצלמה כך שלא יהיו פיקסלים רוויים ותמונה ברורה של הסיבים.
2. הקלט חי או צלם תמונה ראשונית.
3. ציירו ROI סביב הסיבים ושמרו אותם למדידת ערכי העוצמה הממוצעת במהלך הקלטות (איור 1A).
4. עבור הקלטות סיבים מרובים, בדוק את עצמאות האותות.
   1. הקלטה חיה מכל הסיבים.
   2. כוונו סיב אחד לעבר מקור אור והקישו באצבע. תנודות גדולות אמורות להתרחש אך ורק בערוץ זה (דליפה מקובלת 1:1000).
   3. אם האותות אינם עצמאיים, ציירו מחדש ROIs שמרניים יותר וחזרו על מבחן העצמאות.
5. כדי לתייג ולעקוב איזה החזר ROI מתאים לאיזה סיבים, סרט צבעוני או לק ניתן למרוח על קצה הסיבים. צלמו תמונה לפני תחילת כל ניסוי כתזכורת משנית.

3. הקמת זירת הקלטה

1. תלו את כבל התיקון מעל הזירה באמצעות מעמדים, מלחציים או מחזיקים.
2. ודא כי בעל החיים יכול לנוע בחופשיות ברחבי הזירה כולה, ללא עכבות על ידי אורך הסיב.
3. אם נעשה שימוש בקופסת אופרנט או בשדה פתוח, ודא שכבל התיקון יכול להגיע לבעל החיים בכיפוף מינימלי. אם זה דורש חיטוט באף, ודא שיש מספיק מקום מעל הראש כדי למנוע את כיפוף הסיב. הימנע מכיפוף או פיתול מוגזם של כבל המדבקה.

4. הקלטות In vivo

1. בדקו ויזואלית את הקצה הדיסטלי של סיבי כבל המדבקה באמצעות עין ומיקרוסקופ מיניפייבר. אם פני השטח של הסיבים שרוטים, יש ללטש מחדש את הסיבים באמצעות ליטוש/ציפוי סיבים עם חצץ דק (1 מיקרומטר ו-0.3 מיקרומטר).
2. נקו את הקצוות הדיסטליים של כבל המדבקה עם 70% אתנול ומוליך קצה כותנה.
3. נקו את צינוריות הסיבים האופטיים באמצעות 70% אתנול ומוליך קצה כותנה.
4. חבר את קצה המדבקת לסיב המושתל באמצעות שרוול מפוצל קרמי המכוסה בצינור כיווץ שחור. ודא שהשרוול הדוק במהלך החיבור. אחרת, השתמש בשרוול חדש.
   הערה: אם יש רווח כלשהו בין כבל התיקון לבין השתל, תהיה כמות גדולה של אובדן אות, וההקלטות לא יעבדו.
5. אפשרו לבעל החיים להתאושש במשך מספר דקות לפני תחילת הבדיקות ההתנהגותיות.
6. התחל להקליט את האות האופטי והפעל את הניסוי.
7. בזמן ההקלטה, עקוב בקפידה אחר המעקב החי כדי להבטיח הקלטות איכותיות. האות צפוי לרדת במהירות כפונקציה של הזמן בשתי הדקות הראשונות של ההקלטה. השפעה זו נגרמת על ידי דעיכת LED בתיווך חום, לפיה העלייה בחום מגבירה את התנגדות האלמנט האופטי.
8. אם מתרחשת קפיצה באות החורג מהקינטיקה של הפעלה/כיבוי של GCaMP, הדבר מצביע לעתים קרובות על כך שהשרוול אינו הדוק מספיק והרווח בין כבל התיקון לשתל משתנה. במקרה זה, להפסיק את הניסוי ולחבר מחדש את החיה באמצעות שרוול חדש.

תוצאות

איור 1: סכמת פוטומטריית סיבים. (A) אור העירור משתי נורות LED (410 ננומטר ו-470 ננומטר) עובר דרך סדרה של מסננים ומראות דיכרואיות ומייצר נקודת עירור במרחק העבודה של המטרה פי 20. האור עובר דרך כבל טלאי יחיד או סיבים מצורפים (להקלטות מרובות אתרים) המחוברים לצינוריות המושתלות. הפלואורסצנטיות הנפלטת נאספת על ידי אותם סיבים, מסוננת ומוקרנת על חיישן מצלמת CMOS. בתמונות שצולמו, עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת נר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בורג מכסה נירוסטה בגודל 1/4 אינץ' -20, באורך 1 אינץ'	תורלאבס	SH25S100
בורג מכסה מפלדת אל-חלד בגודל 1/4 אינץ'-20, באורך 1/2 אינץ'	תורלאבס	SH25S050
בורג מכסה נירוסטה בגודל 1/4 אינץ' -20, באורך 3/8 אינץ'	תורלאבס	SH25S038
1000 מיקרומטר, 0.50 NA, SMA-SMA כבל תיקון סיב	תורלאבס	M59L01
עמוד אופטי 12.7 מ"מ	תורלאבס	TR30/מטר
מחזיק עמוד פדסטלי 12.7 מ"מ	תורלאבס	PH20EM
15 וולט, 2.4 יחידת ספק כוח עם מחבר שקע 3.5 מ"מ עבור T-Cube	תורלאבס	KPS101
יעד פי 20	תורלאבס	RMS20X
קוביית כלוב 30 מ"מ עם תושבת מסנן Dichroic	תורלאבס	CM1-DCH/M
405 ננומטר LED	עדשות דוריות	CLED_405
מסנן פס פס של 410 ננומטר	תורלאבס	FB410-10
465 ננומטר. לד	עדשות דוריות	CLED_465
מסנן פסים של 470 ננומטר	תורלאבס	FB470-10
מסנן פסים של 560 ננומטר	סמרוק	FF01-560/14-25
560 ננומטר LED	עדשות דוריות	CLED_560
תושבת קינמטית בעלת 5 צירים	תורלאבס	K5X1
כפיל אכרומטי	תורלאבס	AC254-035-A-ML
מתאם לקולימטור 405	תורלאבס	AD11F
מתאם לקולימטור מוצדק	תורלאבס	AD127-F
לוח לחם אלומיניום	תורלאבס	MB1824
מזלג הידוק	תורלאבס	CF125
מחבר קוביה	תורלאבס	CM1-CC
כפול 493/574 דיכרואי	סמרוק	FF493/574-DI01-25x36
מסנן פליטה עבור GCaMP6	סמרוק	FF01-535/22-25
מארז עם לוחות קשיחים שחורים	תורלאבס	XE25C9
מכסה קצה חיצוני עם הברגת SM1 לעיבוד שבבי	תורלאבס	SM1CP2M
מחזיק מסנן צינור עדשת SM1 לשינוי מהיר	תורלאבס	SM1QP
קולימטור קבוע לאור 405 ננומטר	תורלאבס	F671SMA-405
קולימטור קבוע עבור אור 470 ו 560 ננומטר	תורלאבס	F240SMA-532
מסנן פליטה ירוק	סמרוק	FF01-520/35-25	במפצל קרן אור
מצלמת USB 3.0 CMOS ברזולוציה גבוהה	תורלאבס	DCC3260M
מפצל קרן אור	נוירופוטומטריה	חלק
מראה Dichroic Longpass, חיתוך 425 ננומטר	תורלאבס	DMLP425R
מראה Dichroic Longpass, חיתוך 495 ננומטר	סמרוק	FF495-DI03
מלט דנטלי Metabond	ג&ב
כבל M8 - M8	עדשות דוריות	Cable_M8-M8
צינוריות סיבים אופטיים	עדשות דוריות		יש לציין כי אלה ישמשו לניסויי פוטומטריה הדורשים אוטופלואורסצנטיות נמוכה
כבלי תיקון סיב אופטי	עדשות דוריות		יש לציין כי אלה ישמשו לניסויי פוטומטריה הדורשים אוטופלואורסצנטיות נמוכה
מסנן פליטה אדום	סמרוק	FF01-600/37-25	במפצל קרן אור
T7 LabJack	לאבג'ק
מנהל התקן LED T-cube	תורלאבס	LEDD1B
כבל קלט/פלט USB 3.0, Hirose 25, עבור DCC3240	תורלאבס	תא הנהג-DCU-T3

אופטי