מחקר אלקטרופיזיולוגי של סינפסות רטינוגניקולאט וקורטיקוגניקולאט בפרוסות מוח עכבר

תקציר

מקור: Chen, X., et al. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse function. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון מתאר את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית של סינפסות רטינוגניקולאט וקורטיקוגניקולאט בפרוסות מוח של עכבר. הפרוסות המכילות את גרעין הגניקולאט הגבי הצידי (dLGN) ממוקמות בתא הקלטה. פיפטה מגרה ממוקמת על מערכת הראייה כדי לעורר תאי גנגליון ברשתית (RGCs) ולחקור סינפסות רטינוגניקולאט, או את גרעין הרשתית תלאמי כדי לעורר נוירונים בקליפת המוח ולחקור סינפסות קורטיקוגניקולטיות. עם הגירוי, ה-RGCs והנוירונים בקליפת המוח משחררים מוליכים עצביים מעוררים, אשר מייצרים זרמים סינפטיים בנוירוני ממסר LGN. זרמים אלה נרשמים באמצעות פיפטה הקלטה מהדק טלאי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. פתרונות

1. פתרון דיסקציה
   1. כדי להפחית את האקסיטוטוקסיות, הכינו תמיסה מבוססת כולין לשימוש במהלך הדיסקציה כפי שמוצג כאן (במ"מ): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 כולין כלוריד, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂ ו-25 גלוקוז. הכינו את תמיסת הדיסקציה פחות משבוע לפני הניסוי.
2. פתרון הקלטה
   1. הכינו תמיסת נוזל שדרה מוחי מלאכותי (ACSF) המכילה (ב-mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ ו-25 גלוקוז. הוסף 50 μM D-2-Amino-5-phosphonovaleric acid (D-APV) ו- 10 μM SR 95531 hydrobromide (gabazine) כדי לחסום קולטני N-methyl-D-aspartate (NMDA) ו- GABAA, בהתאמה.
3. תמיסה תוך-תאית
   1. הכינו תמיסה תוך-תאית המכילה (ב-mM): 35 Cs-gluconate, 100 CsCl, 10 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 10 אתילן גליקול tetraacetic acid (EGTA), ו-0.1 D-600 (methoxyverapamil hydrochloride). כוונן את ה- pH ל- 7.3 עם CsOH. סנן, aliquot ואחסן את תמיסת המלאי ב -20 °C עד לשימוש.

2. דיסקציה

1. הכינו שני תאי פרוסה, מתוכם אחד מלא 100 מ"ל של תמיסת דיסקציה והשני עם 100 מ"ל של תמיסת הקלטה. הכניסו את שתי הכוסות לאמבט מים (37°C) ובעבעו את התמיסות עם קרבוגן למשך 15 דקות לפחות לפני הנתיחה.
2. מלאו פלסטיק ב-250 מ"ל של תמיסת דיסקציה כמעט קרה כקרח (אך לא קפואה). יש לבעבע עם קרבוגן לפחות 15 דקות לפני השימוש.
3. ממלאים צלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ על 20 מ"מ), בה תבוצע דיסקציה מוחית, בתמיסת הדיסקציה הקרה. הכניסו פיסת נייר סינון למכסה צלחת הפטרי.
4. מצננים את תא הדיסקציה של הוויברטום.
5. מרדימים עכבר עם 2.5% איזופלורן, למשל בכלוב העכבר. ברגע שהעכבר אינו מגיב לצביטת זנב, ערפו את ראשו של העכבר ליד מדולה צוואר הרחם וטבלו את הראש בתמיסת הדיסקציה הקרה כקרח בבסיס צלחת הפטרי.
6. חותכים את עור הראש מ caudal לאף ולשמור אותו לרוחב עם אצבעות לחשוף את הגולגולת. כדי להוציא את המוח הקדמי, תחילה חתכו את הגולגולת יחד עם קו האמצע האחורי-קדמי, ואז חתכו פעמיים נוספות דרך התפר הקורונלי ותפר הלמבדואיד (איור 1A).
7. הסר את הגולגולת בין תפר העטרה לתפר הלמבדואיד כך שהמוח חשוף. חתכו את פקעת הריח והפרידו את המוח הקדמי מהמוח התיכון בעזרת להב דק (איור 1B). מוציאים את המוח מהגולגולת בעזרת מרית דקה ומניחים אותו על נייר הסינון במכסה צלחת הפטרי.
   הערה: שלבים 2.6 ו -2.7 צריכים להתבצע מהר ככל האפשר כדי להפחית מוות תאי.
8. כדי לשמר את שלמות הקלט החושי וקליפת המוח ל-dLGN בפרוסת המוח, הפרידו בין שתי ההמיספרות בעזרת חתך פאראסגיטלי בזווית של 3-5° (איור 1C, D). יבשו את המישורים הבינוניים של שתי ההמיספרות על-ידי הצבתם על נייר הפילטר ולאחר מכן הדביקו אותם על שלב החיתוך בזווית של 10-25° מהמישור האופקי (איור 1E).
9. הניחו את הבמה במרכז מגש החיץ המתכתי ומזגו בעדינות את שאר תמיסת הדיסקציה הקרה כקרח לתוך מגש החיץ. בצעו את השלב הזה בזהירות מאחר שמזיגה חזקה עשויה להסיר את המוח המודבק (איור 1F).
10. הניחו את מגש החיץ במגש מלא קרח, מה שעוזר לשמור על הטמפרטורה הנמוכה במהלך הנתיחה. חותכים פרוסות של 250 מיקרומטר עם סכין גילוח במהירות של 0.1 מ"מ לשנייה ומשרעת של 1 מ"מ.
11. שמור פרוסות בתא האחיזה מלא בתמיסת דיסקציה מחומצנת ב 34 ° C במשך כ 30 דקות ולאחר מכן לאפשר את הפרוסות להתאושש בתמיסת ההקלטה ב 34 ° C במשך 30 דקות נוספות.
12. לאחר ההתאוששות, הוציאו את תא האחיזה של הפרוסה מאמבט המים ושמרו את הפרוסות בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש בניסויים.

3. אלקטרופיזיולוגיה

1. משוך פיפטות באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט ומושך חוטים. שמור על ההתנגדות של פיפטות הקלטה ב 3-4 MΩ. משוך פיפטות מעוררות באמצעות אותו פרוטוקול אך שבור מעט את הקצה לאחר המשיכה כדי להגדיל את הקוטר. מלאו פיפטות הקלטה בתמיסה התוך תאית ובביוציטין, תוך מילוי פיפטות מעוררות בתמיסת ההקלטה.
2. הכניסו את הפרוסות לתא ההקלטה והמשיכו לחורר את הפרוסות בתמיסת הקלטה מחומצנת ב-RT. בדקו את כל הפרוסות ובחרו את הפרוסות המציגות מערכת אופטית שלמה.
3. דמיינו את הפרוסה והתאים במיקרוסקופ זקוף המצויד במיקרוסקופ וידאו מסוג IR-DIC (IR-DIC) עם ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית אינפרא אדומה.
   הערה: נוירוני ממסר נבדלים מתאי עצב פנימיים על ידי גודל הסומה הגדול יותר שלהם ודנדריטים ראשוניים יותר (ענפים היוצאים מהסומה). נוירונים בין-עצביים מציגים מורפולוגיה דו-קוטבית עם סומא קטן יותר.
4. מניחים את הפיפט המגרה על הפרוסה לפני תיקון התא עם פיפטת ההקלטה. כדי לחקור סינפסות רטינוגניות, הניחו את הפיפטה המגרה ישירות על מערכת הראייה, שם סיבי האקסון מתאי גנגליון ברשתית ארוזים (איור 2A). כדי לנתח סינפסות קורטיקוגניקולטיות, מקמו את האלקטרודה המגרה על גרעין הרשתית התלאמי, אשר צמוד באופן רוסטרובנטרלי ל-dLGN (איור 2B).
5. לאחר שפיפטת ההקלטה שקועה בתמיסת ההקלטה, החל שלב מתח של 5 mV כדי לפקח על התנגדות הפיפטה. הגדר את פוטנציאל ההחזקה ל- 0 mV ובטל את פוטנציאל הקיזוז כך שזרם ההחזקה יהיה 0 pA.
6. התקרב לתא עם פיפטת ההקלטה תוך הפעלת לחץ חיובי. כאשר פיפטה נמצאת במגע ישיר עם קרום התא, שחררו את הלחץ החיובי, והגדירו את פוטנציאל ההחזקה ל -70 mV. הפעילו לחץ שלילי קל כדי לאפשר לקרום התא להיצמד לפיפטת הזכוכית כך שייווצר חותם ג'יגה (התנגדות >1 GΩ). לפצות את קיבול פיפטה ולפתוח את התא על ידי יישום של פולסים לחץ שלילי.
7. כדי לחקור את הפונקציה הסינפטית, הפעל פולסי זרם של 0.1 אלפיות השנייה (בערך 30 μA) דרך פיפטת הגירוי. אם לא נצפו תגובות סינפטיות, ייתכן שיהיה צורך להחליף את הפיפטות המעוררות. היזהר במהלך הצבת פיפטות מגרה במיקום אחר, כך התא נרשם לא יאבד.
   הערה: בהקלטות לדוגמה שמוצגות באיור 2, פלסטיות סינפטית לטווח קצר נחקרה על-ידי גירוי מערכת הראייה או סיבי קורטיקוגניקולאט פעמיים במרווחים של 30 מילישניות בין גירויים. יחס הדופק הזוגי (PPR) חושב על ידי חלוקת המשרעת של הזרם הפוסט-סינפטי המעורר השני (EPSC) בזה של EPSC הראשון (EPSC2/EPSC1). כל פרוטוקול גירוי חזר על עצמו 20 פעמים. משרעת EPSC נמדדה מהזרמים הממוצעים של 20 המטאטאים. מרווח הזמן בין כל חזרה היה לפחות 5 שניות כדי למנוע פלסטיות לטווח קצר הנגרמת על ידי החזרות.
8. נטר את התנגדות הסדרה ברציפות על ידי החלת שלב מתח של 5-mV. השתמש רק בתאים עם התנגדות סידרה קטנה מ- 20 MΩ לניתוח.

תוצאות

איור 1: תוכניות המייצגות את פרוטוקול הנתיחה. (A) מבט אופקי על גולגולת העכבר, המראה את מיקום החתכים הראשוניים. החתך הראשון בוצע יחד עם תפר הסגיטלי, ואחריו שני חתכים נוספים יחד עם תפר העטרה ותפר הלמבדואיד, בהתאמה. קווים מקווקווים מייצגים את החתכים. (B) מבט קשת על המוח כולו. קווים מקווקווים מצביעים על כך שהמוח מבודד מנורת הריח ומהמוח האמצעי. (ג-ד) לוחות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגבר	הקה אלקטרוניק	מגבר מהדק תיקון כפול EPC 10 USB
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
כולין כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	C1879-1KG
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי	לייקה מיקרוסיסטמס	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	הכנה עצמית		מכיוון שלא היה Cs-gluconate מסחרי, הכנו אותו בעצמנו
D-600	סיגמא-אולדריץ'	M5644-50MG
D-APV	ביוטרנד	BN0085-100
מצלמה דיגיטלית למיקרוסקופ O	אולימפוס	XM10
EGTA	סרווה	11290.02
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	49159-1 ק"ג
HEPES	רוט	9105.2
מבודד גירוי זרם גבוה	מכשירים מדויקים בעולם	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
מיקרומניפולטורים	Luigs &; Neumann	SM7
מירוסקופ	אולימפוס	BX51
אמצעי הרכבה	תרמופישר סיינטיפיק	P36930
NaCl	רוט	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
פיפטה	הילגנברג	1807502
פולר	סאטר	P-1000
סכין גילוח	פרסונה	60-0138
ויברטום חצי אוטומטי	לייקה ביוסיסטמס	VT1200S
SR 95531 הידרוברומיד	ביוטרנד	AOB5680-10	אנטגוניסט קולטן GABAA