השתלת מערכת מיקרואלקטרודות דו-כיוונית אלחוטית במוח של חולדה

Abstract

מקור: Melo-Thomas, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56299">A Wireless Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Acting Choicely Choices. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון מדגים הליך להשתלת יחידת אלקטרודה רב-ערוצית דו-ערוצית אלחוטית במוח חולדה כדי להקליט ולעורר רשתות עצביות רב-ערוציות.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בעלי חיים

1. חולדות וויסטאר בוגרות (200-250 גרם) בקבוצות של 3-4 בתנאי מעבדה סטנדרטיים לפחות שבוע לפני הניתוח כדי לאפשר התאקלמות.
2. יומיים לאחר הניתוח, חולדות הבית בזוגות. מכסים כלובים בודדים במכסים אקריליים גבוהים. הימנעו מעפעפיים קונבנציונליים העשויים מרשת מתכת מכיוון ששתלים יכולים להיתקע, מה שמגדיל את הסיכון שהם ייפגעו ו / או לא יציבים לאורך זמן.

2. ניתוח סטריאוטקטי

1. לפני תחילת הניתוח, ארגן והכן את הציוד והחומרים הבאים:
   1. הצטיידו בציוד כירורגי סטרילי המורכב מספריים סטריליים, מלקחיים קהים, מרית, קוצץ כירורגי, מקדחה דנטלית וצמר גפן.
   2. להשיג תרופות וכימיקלים כולל isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride, dexpantenol eye salve, 3% מי חמצן, יוד פובידון ו 70% אתנול.
   3. קבל חומר קיבוע כולל ברגי נירוסטה, שרף אקרילי, דבק אולטרה סגול ומגן מכסה.
   4. קבל יחידת מיקרואלקטרודה, המורכבת מ- (i) אלקטרודה בודדת מקליטה (מיקרואלקטרודת טונגסטן פלטינה מבודדת מזכוכית קוורץ, עם צורת קצה חרוטית, קוטר חיצוני: 80 מיקרומטר, קצה חרוט, עכבה ב 1 קילוהרץ: 500 קילומטר) או טטרודה (זכוכית קוורץ פלטינה מבודדת / טונגסטן 4 ליבות מיקרואלקטרודה, קוטר חיצוני: 100 מיקרומטר, קצה חרוט, עכבה ב 1 קילוהרץ: 500-800 kOhm); (ii) אלקטרודת גירוי (חוט פלטינה/אירידיום (90% פלטינה, 10% אירידיום), קוטר ליבה 125μm, קוטר חיצוני 150 מיקרומטר, עכבה <10 kOhm) המחוברת ללוחית מגע ו-(iii) אלקטרודת ייחוס חוט פלטינה (קוטר פיר, 100 מיקרומטר; איור 1A).
   5. השג מחזיק אלקטרודות מודבק בדבק מסיס במים ליחידת המיקרואלקטרודות ובדוק את הפונקציונליות לפחות שעתיים מראש (איור 1B).
   6. השג מערכת קשירה קונבנציונלית המורכבת מקדם-מגבר דיפרנציאלי, מגבר ראשי ומגבר מסנן פסים להקלטות.
   7. הצטיידו בחומר נוסף, כגון כפפות, כרית חימום, מזרקים ומי מלח פיזיולוגיים.
   8. יש להצטייד בכלובים ביתיים (אורך x רוחב x גובה: 42 ס"מ x 26 ס"מ x 38 ס"מ).
2. הליך
   הערה: השתלת אלקטרודה מבוצעת במהלך ניתוח סטריאוטקטי קונבנציונלי תחת הרדמה איזופלורנית.
   1. ודאו שהנסיין לובש כפפות, מסכה כירורגית וחלוק מעבדה.
   2. התחל הרדמה על ידי הנחת בעל החיים בתא אינדוקציה (איזופלורן 4-5%, זרימת חמצן 1 ליטר / דקה, משך ~ 5 דקות).
   3. בדוק אובדן רפלקסים (רפלקסים זנב ובוהן) עם מלקחיים כדי לאשר הרדמה עמוקה.
   4. הניחו את ראש בעל החיים במסכת הרדמה המקובעת סביב המוט החותך העליון של המסגרת הסטריאוטקטית וכווננו את חומר ההרדמה (איזופלורן 2-3%, זרימת חמצן 0.7-0.8 ליטר/דקה).
   5. תקן ויישר אופקית את ראש בעל החיים במנגנון הסטריאוטקטי באמצעות מוטות אוזניים ומוט חותך עליון.
   6. לגלח את שדה הניתוח באמצעות קוצץ כירורגי או מספריים ולעקר עם פובידון-יוד.
   7. הניחו את בעל החיים על כרית חימום למניעת היפותרמיה וטפלו בעיניים עם משחת עיניים דקספנתנול כדי למנוע מהן להתייבש.
   8. הזרקת קסילוקאין (0.3-0.4 מ"ל, תת עורית, s.c.) במרכז שדה הניתוח.
   9. בדוק שוב אובדן רפלקסים.
   10. בצע חתך קטן (1.5 ס"מ) עם אזמל באמצע שדה הניתוח כדי לחשוף את הגולגולת. יש להפריד את העור בעדינות ולהסיר שאריות רקמה באמצעות מלקחיים, מספריים ומרית.
   11. נקה בזהירות את הגולגולת באמצעות ניצני כותנה מצופים מי חמצן.
   12. מקדחים 4-5 חורים קטנים (4.7 מ"מ) בגולגולת לקיבוע ברגי נירוסטה.
   13. חברו את יחידת המיקרואלקטרודות/מחזיק האלקטרודות לקדם-מגבר וחברו אותו למיקרומניפולטור הסטריאוטקטי (איור 1B ו-1C).
   14. קדח חור (כ-7 מ"מ) בגולגולת מעל אזור המטרה באמצעות קואורדינטות מאטלס המוח בהתאם לחיה שבה נעשה שימוש. במחקר הנוכחי, מקמו את קצות האלקטרודות המכוונות לקוליקולוס התחתון באמצעות הקואורדינטות הבאות, כאשר הברגמה משמשת כנקודת ייחוס: קדמית/אחורית, -8.8 מ"מ; מדיאלי/לרוחב, 1.5 מ"מ; וגבי/גחוני, 3.5 מ"מ.
   15. לספוג כל דם עם ניצני כותנה.
   16. הכניסו אנכית את יחידת המיקרואלקטרודות עד שקצות האלקטרודות יגיעו לאזור המטרה.
   17. מקם את כבל הארקה לאורך ברגי הנירוסטה ומתחת לעור.
   18. נטרו את פעילות הספייק והתאימו בזהירות את מיקום האלקטרודות באמצעות מיקרומניפולטור עד להגעה לאזור של נוירונים פעילים במבנה המטרה וזהו פעילות עצבית עם יחס אות לרעש המתאים למיון ספייק.
   19. תקן את יחידת המיקרואלקטרודות לגולגולת עם דבק אולטרה סגול וכסה את צלחת המגע והברגים בשרף אקרילי.
   20. הזריקו מי מלח פיזיולוגיים (1 מ"ל i.p.) וטרמדול (25 מ"ג/ק"ג, s.c.) כדי למנוע התייבשות ולהבטיח שיכוך כאבים לאחר הניתוח, בהתאמה.
   21. נתקו את יחידת המיקרואלקטרודות ממחזיק האלקטרודות באמצעות מברשת ספוגה במים.
   22. הפסיקו את ההרדמה, והוציאו בזהירות את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקטית. נתק את המגבר המקדים מיחידת המיקרואלקטרודות.
   23. חבר את הגנת המכסה על יחידת המיקרואלקטרודות שהושתלה ונתק אותה רק במהלך הליכי הניסוי.

Results

איור 1: יחידת מיקרואלקטרודות TWS. (1) הקלטת אלקטרודה בודדת/טטרוד, (2) אלקטרודת גירוי, (3) לוח חיבור סיבי אלקטרודה, (4) כבלי חיבור גמישים, (5) חוט הארקה, (6) לוח מחברים, (7) מחבר זכר או נקבה למערכת TWS (A); יחידת מיקרואלקטרודות TWS המחוברת לקדם-מגבר (8) ולמחזיק (9); (B) מוכן לחיבור למסגרת סטריאוטקסית (C).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מערכת אלחוטית תומאס (TWS) גרסה 2.0	תומאס הקלטה GmbH	AN001165	מערכת תומאס אלחוטית (TWS) גרסה 2.0 היא מערכת טלמטריה רב-ערוצית ניידת עם מחשב נייד, מערכת הפעלה מותקנת מראש של Microsoft Windows ותוכנת בקרת TWS. ה- TWS כולל: מגבר ראשי בעל 4 ערוצים בעלי רעש נמוך מראש וניתן לתכנות עם רוחב פס קבוע, ממריץ זרם קבוע בערוץ יחיד ליישום פולסי זרם דו-פאזיים, מיקרו סטימולטור הניתן לתכנות, מערכת מחברים מושתלת ויחידת שלב ראש בסיסית להרכבה על בעל חיים. המערכת מסופקת עם מקלט-משדר עם חיבור יציאת USB עבור מחשבים ניידים או מחשבים אישיים שולחניים, תוכנת הבקרה הפועלת תחת מערכת ההפעלה Microsoft Windows. מערכת TWS יכולה לשמש לגירוי עצבי חוץ-תאי ולהקלטה בבעלי חיים קטנים המתנהגים בחופשיות (למשל חולדות, שרקנים). מערכת זו יכולה להיות מותאמת לשימוש גם בבעלי חיים גדולים יותר (למשל פרימטים).
תוכנה עבור Thomas Wireless System (TWS)	תומאס הקלטה GmbH	נכלל בשנת AN001165	התוכנה למערכת האלחוטית Thomas פועלת תחת מערכת ההפעלה Microsoft Windows ומספקת את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) עבור מערכת Thomas Wireless System (TWS). ממשק המשתמש הגרפי של TWS מציע שליטה מלאה בפונקציות TWS, הקלטת 4 ערוצים וגירוי ערוץ אחד.
טטרוד מושתל להקלטה (4 ערוצים) וגירוי (ערוץ יחיד)	תומאס הקלטה GmbH	AN001132	טטרוד מושתל להקלטה (4 ערוצים) וגירוי (ערוץ יחיד) לשימוש עם Thomas Wireless Systems (TWS). מפרט הקלטה של טטרוד: חומר סיבי טטרוד: זכוכית קוורץ סיבי טונגסטן פלטינה מבודדים, סיבי טטרוד קוטר חיצוני: 100μm, צורת קצה D, עכבה 0.5-0.8MOHm; אלקטרודת ייחוס: צורת קצה: D; עכבה: 300-500kOhm; חומר: קוורצגלס פלטינה מבודדת / טונגסטן; מפרט אלקטרודת גירוי: חומר סיבים: פלטינה/אירידיום, קוטר: 125μm, מבודד לכה, צורת קצה : D, עכבה: < 10kOhm, מידות האלקטרודה ניתנות לציון על ידי משתמש הקצה
מיקרואלקטרודה מושתלת להקלטה (ערוץ יחיד) וגירוי (ערוץ יחיד)	תומאס הקלטה GmbH	AN001118	מיקרואלקטרודה מושתלת להקלטה (ערוץ יחיד) וגירוי (ערוץ יחיד) לשימוש עם Thomas Wireless Systems (TWS). מפרט אלקטרודות הקלטה: חומר סיבי אלקטרודה: זכוכית קוורץ סיבי טונגסטן פלטינה מבודדים, סיבי אלקטרודה קוטר חיצוני: 80μm/250μm (נא לפרט), צורת קצה D, עכבה 0.5-0.8MOHm; אלקטרודת ייחוס: צורת קצה: D; עכבה. 300-500kOhm; חומר: קוורצגלס פלטינה מבודדת / טונגסטן; מפרט אלקטרודת גירוי: חומר סיבים: פלטינה/אירידיום, קוטר: 125μm, מבודד לכה, צורת קצה : D, עכבה: < 10kOhm
מחזיק להשתלת אלקטרודות	תומאס הקלטה GmbH	AN000838	מוט מתכת מכופף מיוחד להשתלת מיקרואלקטרודות לבעלי אלקטרודות סטנדרטיים. המוט משמש להחזקת אלקטרודה מושתלת. האלקטרודה המושתלת מקובעת למוט עם דבק מסיס במים (AN001080 מיוחד של Thomas RECORDING). (מחזיק אלקטרודה אינו כלול)
ספק כוח מצבר חלופי למערכת Thomas Wireless (3,7V/230mAh)	תומאס הקלטה GmbH	AN001208	סוללה נטענת חלופית (מצבר) למערכת Thomas Wireless בקיבולת של 230mA למשך כשעה פעולה. (גודל: 27 מ"מ x 20 מ"מ x 6 מ"מ, אפליקציית משקל. 6 גרם)
ספק כוח מצבר חלופי למערכת Thomas Wireless (3,7V/450mAh)	תומאס הקלטה GmbH	AN001209	סוללה נטענת חלופית (מצבר) למערכת Thomas Wireless בקיבולת של 450mA למשך יותר משעה אחת. (גודל: 48 מ"מ x 30 מ"מ x 4 מ"מ, אפליקציית משקל. 11 גרם)
מטען מצבר עבור מצבר נטען Thomas Wireless System (TWS)	תומאס הקלטה GmbH	AN001207	מטען המופעל באמצעות חשמל עבור מצברים נטענים (AN001209 ו-AN001209 של Thomas Wirless System (TWS)
דבק מסיס במים	תומאס הקלטה GmbH	AN001080	דבק אלקטרודות מסיס במים Thomas RECORDING הוא מוצר שנבחר במיוחד לשימוש עם מיקרואלקטרודות מושתלות במחקר מדעי המוח. תכונותיו הייחודיות מבטיחות חיבור קשיח בין האלקטרודה להתקן ההרכבה למרות שהוא נשלף בקלות עם מים חמים. ניתן להשתמש בדבק האלקטרודות המסיסות במים של Thomas RECORDING היישר מהקופסה, ללא הכנה הגוזלת זמן. תומס הקלטה דבק אלקטרודות מסיס במים אינו מזיק לבני אדם, לבעלי חיים או לסביבה. כמות: 1 קופסה של 10 גרם
קדם-מגבר דיפרנציאלי מיניאטורי	תומאס הקלטה GmbH	AN000329	קדם-מגבר דיפרנציאלי מיניאטורי, דגם MDPA-2 הוא קדם-מגבר קלט דיפרנציאלי דו-ערוצי המיועד להקלטות רעש נמוכות מרקמה מעוררת. הוא מיועד להקלטה חוץ-תאית בשילוב עם השתלת מיקרואלקטרודות מושתלות לתנועה חופשית של יישומי בעלי חיים עם מערכת Thomas Wireless System (TWS). קדם-מגבר הדיפרנציאל המיניאטורי הדו-ערוצי (MDPA-2) מחובר למיקרואלקטרודות המושתלות כדי לספק את שלב ההגברה הראשוני פי עשרה. באופן אידיאלי, אלקטרודות פלטינה/טונגסטן מבודדות מזכוכית קוורץ משמשות להפקת תוצאות הקלטה אופטימליות עם אמפליטודות אות גבוהות ורמות רעש נמוכות. ל-MDPA-2 יש בסיס משותף נוסף וכניסות אלקטרודות ייחוס.
כבל חיבור	תומאס הקלטה GmbH	AN000330	כבל חיבור לחיבור קדם-מגבר הדיפרנציאל המיניאטורי תומאס (MDPA-2) למגבר ראשי ולספק כוח מצבר.
ספק כוח נטען למגבר המקדים המיניאטורי	תומאס הקלטה GmbH	AN000328	ספק כוח מצבר נטען עבור קדם-מגבר דיפרנציאלי מיניאטורי (MDPA-2).
מטען מצבר (ארה"ב)	תומאס הקלטה GmbH	AN000167	מטען מצבר עבור AN000328 ספק הכוח (קונקטור שקע חשמל בארה"ב)
מטען מצטבר (EU)	תומאס הקלטה GmbH	AN000168	מטען מצבר עבור AN000328 ספק הכוח (מחבר שקע החשמל של האיחוד האירופי)
קדם-מגבר דיפרנציאלי/מגבר ראשי/מסנן פסים	תומאס הקלטה GmbH	AN000677	מגבר ראשי TREC AC (LabAmp-03) הוא מגבר ראשי דיפרנציאלי חד-ערוצי ליישומים נוירופיזיולוגיים (למשל הקלטה חוץ-תאית עם מיקרואלקטרודות). מכשיר זה נועד לעבוד עם קדם-מגבר דיפרנציאלי מיניאטורי, דגם MDPA-2. הערוץ היחיד של LabAmp-03 מכיל שלב מגבר דיפרנציאלי בעל רווח גבוה ורעש נמוך ואחריו מסננים בתדר נמוך ותדר גבוה. למגבר שני מגברי מסנן שונים, מגבר מסנן יחידה אחת (SUA) ומגבר מסנן פוטנציאל שדה מקומי (LFP), שניהם מחוברים במקביל בנתיב האות. מצב הקלטה מציע שתי רמות של הגברת אות (x10, x100) בשלב הראשון וארבע רמות נוספות (x5, x10, x25 ו- x50) בשלב מגבר סופי. לכל מגבר מאפייני פס פס שונים עבור פעילות יחידה בודדת (SUA) 500Hz...20kHz ופוטנציאלי שדה מקומי (LFP) 0,1Hz...140Hz. צג שמע ומבחין חלונות משולבים בהתקן. LabAmp-03 כולל צג שמע משולב עם רמקול. יחידה זו מספקת שכפול שמע של אותות אלקטרופיזיולוגיים. היחידה משלבת מגבר שמע באריזה קומפקטית ומחוספסת. זה מתאים במיוחד לניטור ירי עצבי והתכווצויות שרירים. קלט צג השמע מחובר באופן פנימי לפלט מגבר SUA-Filter. LabAmp-03 מסופק עם ספק כוח חיצוני לטווח מתח פעולת חשמל של 100-240V AC/50-60Hz.
אוסצילוסקופ USB	תומאס הקלטה GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 קנאל. אוסצילוסקופ מחשב דו-ערוצי זה מושלם לשימוש נייד במחשב נייד ולהתקנה קבועה בארונות בקרה, ציוד תעשייתי ויישומים רבים אחרים בהם נדרש אוסצילוסקופ קטן, קל משקל ורב עוצמה. אוסצילוסקופ זה מחובר לפלט האות של המגבר הראשי להצגת פעילות חוץ-תאית מוקלטת במהלך תכנון המיקרואלקטרודות המושתלות עבור מערכת Thomas Wireless System (TWS). המשתמש יכול לקבל את נתוני המדידה על פני מספר ממשקי נתונים ישירות במחשב עם תוכנת מחשב כלולה.
מחולל תמריצים	מערכות רב ערוציות	STG3008-FA	מחולל גירויים לזרם (STG) וגירוי מונע מתח ממלאים שלוש פונקציות: גירוי מונע זרם, גירוי מונע מתח, שליטה ותזמון. STG זמין עם 2, 4 או 8 ערוצי פלט independet. עם יחידות בידוד משולבות עבור כל ערוץ פלט, STG מסוגל לספק כל צורת גל שרירותית.
מגן מכסה לאלקטרודה	תומאס הקלטה GmbH	AN001193	מכסה מגן ליחידת אלקטרודות מושתלות עבור מערכת Thomas Wireless
ציוד כירורגי			מספריים, מלקחיים קהים, מרית, קוצץ כירורגי, מקדחה דנטלית וצמר גפן
תרופות וכימיקלים			איזופלורן, קסילוקאין, טרמדול הידרוכלוריד (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, אולם, גרמניה), משחת עיניים דקספנטנול (Bepanthen, Bayer AG, לברקוזן, גרמניה), 3% מי חמצן, פובידון-יוד (Betaisodona, Mundipharma GmbH, לימבורג, גרמניה) ו-70% אתנול;
חומר קיבוע כולל			ברגי נירוסטה (BN650 M1.2x5; 4.7 מ"מ), שרף אקרילי (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, גרמניה), דבק אולטרה סגול (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, גרמניה) ומגן מכסה (Thomas Recording GmbH, Giessen, גרמניה);
חומר נוסף			כפפות, כרית חימום, מזרקים ומי מלח פיזיולוגיים.
מכשיר סטריאוטקסי של חיות קטנות (SASI)	תומאס הקלטה GmbH	AN000287	יש לבחור את המודל על פי בעל החיים (חולדה, שרקן, קופים וכו ') המשמש במחקר
מצלמת וידאו	אברפוקוס		EverFocus, דגם: EQ150