פוטו-טימולציה והקלטות מהדק טלאי של תא שלם של תאי עצב בפרוסות היפוקמפוס עכבר

תקציר

מקור: Richevaux, L., et al. In vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse sgrices. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון מדגים פרוטוקול לחקר אינטראקציות סינפטיות ותגובות עצביות בפרוסת מוח של עכבר נגוע בהיפוקמפוס. היא כוללת הארת נוירונים חושיים ארוכי טווח כדי להפעיל פוטנציאלי פעולה ורישום הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים המעוררים המתקבלים בתא העצב המוקלט באמצעות טכניקת מהדק טלאי של התא כולו.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. פתרונות להקלטות פרוסות חריפות

1. הכינו תמיסות מלאי של 10x תמיסת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) (124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 1 mM NaH₂PO₄ ו-11 mM D-glucose) במים טהורים שעברו דה-יוניזציה לפני ניסויים אלקטרופיזיולוגיים. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C בבקבוק 1 ליטר ללא CaCl₂ ו-MgCl₂.
2. הכינו את תמיסת פיפטה מבוססת אשלגן-גלוקונאט כך שתכיל 135 mM K-gluconate, 1.2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl₂, 4 mM MgATP, 0.4 mM Tris-GTP, 10 mM Na 2-phosphocreatine ו-2.7-7.1 mM biocytin לגילוי מורפולוגיית תאים פוסט-הוק. כוונן את רמת החומציות של התמיסה ל-7.3 ואת האוסמולריות ל-290 mOsm. יש לאחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C.

2. הקלטת מהדק טלאי של תא שלם

1. העבירו בעדינות פרוסת מוח המכילה את קומפלקס ההיפוקמפוס עם פיפטת העברת זכוכית בהתאמה אישית לתא ההקלטה המורכב על מיקרוסקופ זקוף. פיפטת העברה עשויה פיפטת פסטר מקוצרת (קוטר פנימי 6.5 מ"מ) המחוברת לנורת פיפטה מגומי. יש לנקב ברציפות את תא ההקלטה (3 מ"ל) עם 34°C (מחומם) aCSF מבעבע עם 95%/5% O₂/CO₂. הגדר את מהירות המשאבה הפריסטלטית ל- 2-3 מ"ל/דקה.
2. בחן בקצרה את ביטוי Chronos-GFP בהדקי אקסונים באזור העניין עם תאורת LED כחולה (470 ננומטר) והתבונן במטרה 4x. פלואורסצנטיות GFP מוצגת באמצעות מסנן פליטה מתאים, עם תמונת מצלמת CCD המוצגת על מסך מחשב.
3. הניחו על הפרוסה עוגן פרוסה עשוי מחוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון במרווחים הדוקים ("נבל") כדי לשמור עליו.
4. שנו למטרה של טבילה פי 63 וכווננו את המיקוד. בדוק אקסונים המבטאים Chronos-GFP ובחר נוירון פירמידלי לרישום טלאי.
5. הזיזו את המטרה כלפי מעלה.
6. משוך פיפטות באמצעות מושך אלקטרודות חום-בוער מזכוכית בורוסיליקט. המושך מתוכנן לייצר פיפטות בקוטר של כ-1 מיקרומטר. מלאו את פיפטות בתמיסה פנימית מבוססת K-gluconate.
7. הרכיבו את הפיפטה במחזיק הפיפטה על במת הראש. מורידים את הפיפטה בתא ומוצאים את הקצה מתחת למטרה. התנגדות פיפטה צריכה להיות בין 3-8 MΩ. הפעל לחץ חיובי קל עם מזרק כדי לראות חרוט של תמיסה החוצה מתוך פיפטה בהדרגה להוריד את פיפטה מטרה על פני השטח של הפרוסה.
8. תקן את התא בתצורת מהדק מתח: התקרב לתא העצב המזוהה ולחץ בעדינות את קצה הפיפטה על הסומה. הלחץ החיובי אמור לייצר גומה על פני הממברנה. שחררו את הלחץ ליצירת חותם ג'יגה-אוהם (התנגדות >1 GΩ). לאחר האטם, הגדר את מתח האחיזה ל -65 mV. לשבור את הממברנה עם דופק חד של לחץ שלילי: זה מושג על ידי החלת יניקה חזקה על צינור מחובר מחזיק פיפטה.
9. תיעדו במצב מהדק זרם של כל התא את תגובות תא העצב לשלבי זרם היפרפולריזציה ודפולריזציה (איור 1A).
   הערה: פרוטוקול זה ישמש לקביעת התכונות הפנימיות הפעילות והפסיביות של התא. שגרות MATLAB מותאמות אישית משמשות לניתוח לא מקוון.
10. הקלט בתגובות פוסט-סינפטיות של מהדק זרם או מתח לגירוי LED של 475 ננומטר בשדה שלם של סיבים afferent המבטאים כרונוס. גירוי באמצעות רכבות של 10 גירויים של 2 אלפיות השנייה ב-20Hz (איור 1 B, C). עוצמת האור עשויה לנוע בין 0.1 ל-2 mW.
    הערה: עוצמת האור נמדדה באמצעות קונסולת כוח אופטית דיגיטלית ידנית המצוידת בחיישן פוטודיודה, הממוקמת מתחת למטרה. השהיות תגובה של 2-4 אלפיות השנייה אופייניות לחיבור מונוסינפטי.

תוצאות

איור 1: נוירון שכבה קדם-סוביקולרית III: תכונות פנימיות, תגובה לגירוי אור של afferents תלמיים, וגילוי פוסט-הוק של מורפולוגיה של התא. (A) תבנית ירי ושינויים פוטנציאליים בקרום של נוירון שכבה III עבור היפרפולריזציה ודה-פולריזציה של שלבי זרם. (ב, ג) תגובות של נוירון שכבה III לגירויי אור של 2 מילישניות (פסים כחולים) של אקסונים תלמיים שנרשמו במצבי (B) מהדק ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
KCl	סיגמא	עמ' 4504	סופי 1.2 מ"מ
מגנזיום כלורי	סיגמא	63069	סופי 2 מ"מ
MultiClamp 700B	מכשירי אקסון
תוכנת רכישת pClamp	מכשירי אקסון
משאבה פריסטלטית	גילסון	מיניפולס 3	14-16 בתצוגה למשך 2-3 מ"ל/דקה
אשלגן גלוקונאט (K-gluconate)	סיגמא	G4500	סופי 135 מ"מ
נימי בורוסיליקט	מכשיר Havard	GC150-10	1.5 מ"מ חיצוני, 0.86 קוטר פנימי
מושך אלקטרודות חום בוער	סאטר אינסטרומנטס	P-87
EGTA	סיגמא	E4368	סופי 0.2 מ"מ
470 ננומטר LED	מחקר קיירן	P1105/470/לד DC/59022m	יש להשתמש עם מסנן עירור תואם 470/40x ומסנן פליטה עבור GFP
AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	פן וקטור ליבה	AV-5-PV3446	לוט V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
מצלמת CCD	אנדור	DL-604M
מיקרוסקופ קונפוקלי	זיס	LSM710	פי 20
Digidata 1440A	מכשירי אקסון
מד אופטי דיגיטלי ידני	ThorLabs	PM100D	פרמטר על 475 ננומטר
HEPES	סיגמא	H3375	סופי 10 מ"מ
ספק כוח LED	מחקר קיירן	מקור אור OptoLED