ניטור אופטי ואלקטרופיזיולוגי סימולטני של תאי עצב בפרוסות מוח

תקציר

מקור: Murphy, C. A., et al. הפעלה אופטוגנטית של מסלולים afferent בפרוסות מוח אפנון של תגובות על ידי הרדמה נדיפה. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר שיטה לדימות ורישום בו זמנית של פעילות חשמלית מפרוסות מוח טרנסגניות המכילות חלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לנוירונים. ההליך כולל שמירה על פרוסת המוח בתא זילוח עם נוזל מוחי מלאכותי משודר, שימוש במקור אור כדי לעורר תאים המסומנים בפלואורסצנט, ורישום האותות החשמליים באמצעות בדיקה רב-ערוצית ומהדק טלאי.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. הכנת חומרה ותוכנה להקלטות רב ערוציות

1. הגדר מערכת איסוף נתונים של 16 ערוצים בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: ניתן להשתמש במספר מגברים ומערכות איסוף נתונים הזמינים מסחרית כדי לאסוף הקלטות רב-ערוציות. בניסויים המתוארים כאן, אותות אנלוגיים מועברים באמצעות לוח ייחוס אלקטרודות לשני מגברים, שם הם מוגברים (2000x) ומסוננים (0.1-10kHz). כניסות אנלוגיות למערכת איסוף הנתונים עוברות דיגיטציה בקצב של 40kHz.
2. הדקו את מתאם שלב הראש המתאים בן 16 הערוצים למיקרומניפולטור במיקרוסקופ. כוון את המתאם כך שיציאות המחבר הנשיות פונות כלפי מטה.
3. התאם את זווית הפעולה של מיקרומניפולטור זה כך שהוא מכוון כלפי מטה לכיוון תא ההקלטה בזווית של כ -70° ביחס לאופקי.
4. חבר את קלט במת הראש לבדיקה בגודל 16 x 1 עבור אלקטרופיזיולוגיה חוץ גופית באמצעות מתאם שלב הראש המעוגן למיקרומניפולטור.
5. חבר את מחבר פלט במת הראש למערכת איסוף הנתונים.
6. התקן תוכנה מתאימה לרכישת נתונים. הגדר 15 ערוצי קלט כך שיתאימו לאותות קלט מ- 15 אנשי הקשר הרב-ערוציים הראשונים. הגדר את הערוץ הנותר לקבלת קלט מהאלקטרודה התוך-תאית.
   הערה: בעת איסוף וניתוח נתונים, יש להקפיד לשקול מפות אלקטרודות ומתאם כדי לוודא שהאות המתאים מתאים למגע האלקטרודה שממנו הוא נאסף.

2. תצורה של פרוטוקולים לגירוי אור

1. הגדירו מערכת אספקה קלה והתקינו את התוכנה הנלווית.
2. פתח את התוכנה. בחר תצורת חיווט חומרה שבה מקור טריגר (דיגיטלי/TTL (Transistor-Transistor Logic) Out) מספק אות Trigger In למערכת העברת האור, ומערכת העברת האור מספקת אות Trigger Out לנורית LED (דיודה פולטת אור) של 470 ננומטר.
3. הרכבה של עדשה אובייקטיבית בעוצמה גבוהה. באמצעות מצלמה דיגיטלית, כייל יעדים בעלי עוצמה גבוהה באמצעות מערכת העברת האור.
4. צור רצף פרופילים חדש של פרופילי גירוי אור.
   1. צרו תבנית בחירה. בניסויים המתוארים כאן, מעגל בקוטר 150 מיקרומטר מאפשר הפעלה ספציפית לשכבה של הדקי אקסונים.
   2. כדי לבנות רצף פרופילים, העתק והדבק פרופיל זה עבור כל אחד ממספר גירסאות הניסיון.
   3. צור רשימת צורות גל המכילה צורות גל בכל עוצמת אור, משך פולס או מספר פולס
   .
   4. הקצאה אקראית של צורות גל לכל פרופיל. כל פרופיל עם צורת הגל שהוקצתה לו מתאים לפעימת טריגר אחת מתוך קלט TTL דיגיטלי או ניסוי אחד.
   5. שמור את רצף הפרופיל.
5. בתוכנת רכישת הנתונים, צור פרוטוקול חדש.
   1. הגדר את מספר גירסאות הניסיון כך שיהיה שווה למספר הפרופילים ברצף הפרופילים שנוצר.
   2. בחר קלט אות כך שיתאים לאלה שהוגדרו בשלב 1.6. הגדר פרוטוקול המספק פלט TTL דיגיטלי יחיד, המקליט מ- 16 ערוצי קלט אלה למשך פרק זמן מתאים לפני ואחרי ההדק הדיגיטלי.

3. הצבת בדיקה רב ערוצית בפרוסת רקמת מוח ex vivo

1. מחורר eACSF מבעבע (נוזל מוחי מלאכותי ניסיוני) (לא בשקיות אטומות) ב 3-6 מ"ל / דקה.
2. העבירו את פרוסת המוח המכילה אזור מעניין לרשת הרשת בתא זילוח במיקרוסקופ. עוגן עם נבל פלטינה
3. סובבו את רשת הרשת כך שקו מגעי האלקטרודות בקצה הדיסטלי של הגשושית הרב-ערוצית יהיה מאונך בקירוב למשטח הפיאלי.
4. הנמיכו את הגשושית הרב-ערוצית לכיוון פני השטח של הפרוסה תחת תאורת שדה רחב ובקרה עדינה של המיקרומניפולטור.
5. סובב את צריח קוביית המסנן כדי להפעיל את קוביית המסנן המתאימה כדי להמחיש את חלבון הכתב הפלואורסצנטי המתבטא במסופי אקסונים של אפרנטים קליפת המוח. במידת הצורך, סובבו את הפרוסה כדי ליישר את הגשושית בצורה מדויקת יותר עם משטח הפיאל.
6. מקם את הגשושית ממש מעל מישור הפרוסה, ~ 200 מיקרומטר פחות ממיקום המטרה הסופי לאורך ציר ה-x, תוך השארת לפחות תעלה אחת מחוץ לגבול אזור הרקמה המוקלטת.
7. הכנס לאט את הבדיקה לתוך הפרוסה על ידי הזזת המניפולטור לאורך ציר האורך שלה. כדי למזער את הנזק לרקמה, הקדמו את הבדיקה רק במידה שהקצוות החדים נראים רק מתחת לפני השטח של הרקמה. פעולה זו תמזער את הנזק לרקמה ועדיין תבטיח שמגעי האלקטרודות יהיו במגע עם הרקמה.

4. תיקון הידוק נוירונים ממוקדים וקבלת תצורה של תאים שלמים

1. העבר את מקור eACSF לפתרון הבקרה בשקיות.
2. זהה תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי לרישום מהדק טלאי ממוקד.
   1. הגבל את דיאפרגמת קשתית הצמצם לקוטר הקטן ביותר. הפעל עדשה אובייקטיבית בעוצמה נמוכה והבא את הרקמה למיקוד.
   2. מרכז את האור על פני אזור רקמה הסמוך (אך לא חופף) לבדיקה הרב-ערוצית.
   3. הפעילו את המטרה טבילה במים בעוצמה גבוהה (40x או 60x), תוך שימוש זהיר כדי למנוע מגע בין הגשושית הרב-ערוצית לבין עדשת המטרה.
   4. סובב את צריח קוביית המסנן כדי להפעיל את ערכת המסננים המתאימה כדי לאפשר הדמיה של תאים המבטאים סמן פלואורסצנטי תלוי Cre.
   5. זהה תא המסומן באופן פלואורסצנטי כיעד לרישום מהדק טלאי. הרם את עדשת האובייקט כדי ליצור מספיק מקום להורדת פיפטת טלאי.
3. טען פיפטת טלאי (ראה טבלה 1) בתמיסה פנימית (טבלה 2) והרכיב פיפטה למחזיק אלקטרודות. באמצעות מזרק 1 מ"ל, להפעיל לחץ חיובי המתאים ~ 0.1mL אוויר.
4. הורידו את פיפטת המדבקה לתמיסה. הביאו את קצה הפיפטה למיקוד תחת הנחיה חזותית.
5. השג הקלטה של תא שלם מתא היעד באמצעות השלבים שהודגמו קודם לכן33.
6. אם אתם מתכננים להעריך שינויים בתכונות הפנימיות של התא (למשל, התנגדות קלט, קצב ירי פוטנציאלי לפעולה בתגובה לצעדים הנוכחיים), בצעו רישומים אלה. אחרת, עבור לפרוטוקול גירוי האקסון להלן.

טבלה 1: הרכב נוזל השדרה המוחי המלאכותי ותמיסה תוך-תאית. ריאגנטים וריכוזים עבור eACSF, ותמיסת פיפטה תוך תאית עבור הקלטות מהדק טלאי מפורטים.

	ניסוי ACSF, eACSF (ב-mM)
NaCl	111
NaHCO3	35
HEPES	20
KCl	1.8
CaCl2	2.1
MgSO4	1.4
KH2PO4	1.2
גלוקוז	10
	פתרון פנימי
קיי-גלוקונאט	140
NaCl	10
HEPES	10
EGTA	0.1
MgATP	4
NaGTP	0.3
	pH = 7.2

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עדשת 2.5x Broadfield Objective	אולימפוס	פי MPLFLN2.5
עדשת מטרה 40x טבילה במים	אולימפוס	LUMPLFLN40XW
תערובת 95% O2/5% CO2	איירגז	Z02OX95R2003045
בדיקת A16	נוירונקסוס	A16x1-2 מ"מ-100-177-A16	בדיקה בת 16 ערוצים
מוניטור גז הרדמה (POET II)	Criticare	602-3א
סידן כלורי (CaCl2)	נקודה מדעית	DSC20010	ACSF
זכוכית נימית (הקלטות מהדק טלאי)	קינג דיוק זכוכית, Inc.	KG-33	בורוסיליקט, ID: 1.1 מ"מ, OD: 1.7 מ"מ, אורך: 90.0 מ"מ
זכוכית נימית (זריקות ויראליות)	דרמונד סיינטיפיק קומפני	3-000-203-גרם/X	3.5 אינץ'
שליטה במיקרומניפולטור זוטר	לואיגס ונוימן	SM8	לשליטה במיקרומניפולטור זוטר
שליטה במניפולטורים ובהזזת שולחן	לואיגס ונוימן	SM7	לבקרה על אלקטרודה רב ערוצית וטבלה משתנה
Digidata 1440A + Clampex 10	התקנים מולקולריים	1440א	דיגיטציה ותוכנה
צינורות E-3603	פישר סיינטיפיק	14171208	לאספקת 95% תערובת גז O2/5% CO2 לתא הדגירה + הפעלת לחץ במהלך הידוק טלאי
EGTA	נקודה מדעית	DSE57060	תמיסה תוך-תאית
לוח ייחוס/תיקון EEG ERP-27	Neuralynx	בדימוס
מילוי מחט	מכשירים מדויקים בעולם	50821912	למילוי פיפטות מהדק טלאי
קוביית סינון להדמיה EYFP	אולימפוס	U-MRFPHQ
נייר סינון	פישר סיינטיפיק	09801E	הניחו על תבנית פרוסה במהלך הכנת בלוק טישו
מושך מיקרופיפטה בוער/חום	סאטר אינסטרומנט	P-1000	2.5x2.5 חוט תיבה
צינור פיזור גז	סיגמא אולדריץ'	CLS3953312C
מזרק זכוכית (100 מ"ל)	סיגמא אולדריץ'	Z314390	למילוי שקיות אטומות בגז
חומצה גלוקונית, מלח אשלגן (K-גלוקונאט)	נקודה מדעית	DSG37020	תמיסה תוך-תאית
גלוקוז	נקודה מדעית	DSG32040	ACSF
GTP, מלח נתרן	סיגמא אולדריץ'	G8877	תמיסה תוך-תאית
מתאם גשושית ראש	נוירונקסוס	A16-OM16	מתאם לחיבור בדיקה של 16 ערוצים לקלט headstage
HEPES	נקודה מדעית	DSH75030	ACSF, פתרון תוך תאי
HS-16 Headstage	Neuralynx	בדימוס
איזופלורן	פטרסון וטרינרי	07-893-1389
איזופרופיל אלכוהול (70%)	VWR הבינלאומי	101223-746
מיקרומניפולטור זוטר	לואיגס ונוימן	210-100 000 0090-R	למניפולציה של אלקטרודת מהדק טלאי
מודול בקרת מקור אור LED	מייטקס	BLS-PL02_US	בקרת מקור אור אופטוגנטית
מגבר Lynx-8	Neuralynx	בדימוס
ספק כוח Lynx-8	Neuralynx	בדימוס
מגנזיום סולפט (MgSO4)	נקודה מדעית	DSM24300	ACSF
mCherry , טקסס קוביית מסנן אדומה	כרומה	49008	להדמיית כתב פלואורסצנטי tdTomato
מלוקסיקאם
מחזיק מיקרופיפטה	פישר סיינטיפיק	NC9044962
משאבת מיקרומזרק	מכשירים מדויקים בעולם	UMP3-4
MultiClamp 700A	התקנים מולקולריים/מכשירי אקסון	700א	מגבר
חנקן (לשולחן אוויר)	איירגז	NI200
רשת ניילון	פישר סיינטיפיק	501460083	מתוח על פרסה של חוט פלטינה שטוח, פרוסה לנוח על גבי זה במהלך ההקלטות
ניילון, חתוך מגרביונים	מותג גנרי		חתיכה קטנה ליצירת פלטפורמת פרוסה בתא הדגירה, סיבים בודדים ליצירת נבל פלטינה
פיפטה	נקודה מדעית	307	להעברת רקמה למתקן
חוט פלטינה	VWR הבינלאומי	BT124000	2 ס"מ, שטוח, להכנת נבל פלטינה
מצולע400	מייטקס	DSI-E-0470-0617-000	מערכת העברת אור אופטוגנטית, מגיעה עם תוכנת PolyScan2
אשלגן כלורי (KCl)	נקודה מדעית	DSP41000	ACSF
אשלגן פוספט (KH2PO4)	נקודה מדעית	DSP41200	ACSF
שקית גז אטומה	פישר סיינטיפיק	109236
שולחן הזזה למיקרוסקופ	לואיגס ונוימן	380FMU
סודיום ביקרבונט (HCO3-)	נקודה מדעית	DSS22060	ACSF
נתרן כלורי (NaCl)	נקודה מדעית	DSS23020	ACSF, פתרון תוך תאי
מזרק (1 מ"ל) עם קצה LuerLock	פישר סיינטיפיק	309628	להפעלת לחץ במהלך הידוק טלאי
מזרק (1 מ"ל) עם קצה החלקה	WW Grainger, Inc.	19G384	למילוי פיפטות מהדק טלאי
מסנני מזרקים	VWR הבינלאומי	66064-414
מיקרוסקופ זקוף	אולימפוס	BX51
מגבות Wypall	פישר סיינטיפיק	19-042-427