כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. תכשירים טרום ניתוחיים
- הכנת תמיסת אלקטרודות
- כדי להפוך את תמיסת מילוי האלקטרודה, להכין פתרון של 4 M אשלגן אצטט עם 140 mM אשלגן כלורי.
- הכנת אלקטרודות
- באמצעות שאיבת ואקום, הכנס סיבי פחמן T-650 (קוטר 7 מיקרומטר) לתוך נימי זכוכית בורוסיליקט (אורך = 100 מ"מ, קוטר = 1.0 מ"מ, קוטר פנימי = 0.5 מ"מ).
- לאחר שסיבי הפחמן הונחו בתוך נימי הזכוכית, הניחו את נימי הזכוכית לתוך מושך אלקטרודות אנכי, כאשר גוף החימום נמצא בערך באמצע הנימים. כוונו את תנור החימום ל-55 כשהמגנט כבוי.
- לאחר משיכת הנימים, הרם בזהירות את מחזיק הנימים העליון, כך שקצה האלקטרודה לא יהיה מוקף בגוף החימום.
- בעזרת מספריים חדים, חותכים את סיבי הפחמן שעדיין מחברים בין שתי חתיכות הנימים. התוצאה תהיה שתי מיקרואלקטרודות נפרדות מסיבי פחמן.
- תחת מיקרוסקופ אור, חותכים בזהירות את סיבי הפחמן החשופים עם אזמל חד, כך שהוא משתרע בערך 75-100 מיקרומטר מעבר לקצה הזכוכית.
- באמצעות מיקרוסקופ אור, ודא כי האלקטרודה נקייה מסדקים לאורך הנימים וכי האטם שבו סיבי הפחמן יוצאים מהנימים קשה להבחנה ונקי מסדקים.
הערה: אטם טוב יעזור להפחית את הרעש במהלך הקלטות.
- ייצור אלקטרודות ייחוס
- הלחמת סיכת זהב לחוט כסף בקוטר 5 ס"מ.
- חבר את האנודה לאטב נייר מתכתי או למוליך אחר, את הקתודה לסיכה, והפעל מתח (~ 2 V) בזמן שהמהדק וחוט הכסף שקועים ב- 0.1 M HCl.
- הפסק את המתח ברגע שציפוי לבן (AgCl) מופיע על חוט הכסף.
- הכנת אלקטרודות להשתלה
- הלחמת סיכת זהב לחוט מבודד דק (~ 10 ס"מ אורך, <0.50 מ"מ קוטר).
- הסר ~ 5 ס"מ של בידוד מהחוט הנגדי לסיכת הזהב.
- מלא את האלקטרודה בערך באמצע הדרך עם תמיסת האלקטרודה.
- הכנס חוט מבודד לאלקטרודה.
הערה: החוט צריך ליצור מגע עם סיבי הפחמן בתוך האלקטרודה.
2. השתלות אלקטרודות
- יש לתת לחולדות בוגרות, זכריות, Sprague Dawley (250-450 גרם) זריקה תוך צפקית (1.5 גרם/ק"ג או 1 מ"ל/ק"ג נפח) של 0.5 גרם/מ"ל אורתן מומס במי מלח סטריליים. יש להתחיל עם מינון ראשוני של 1.0-1.2 גרם/ק"ג. אם בעל החיים עדיין מגיב למבחן הגירוי המזיק (צביטת זנב) 20 דקות לאחר מתן אורתן, יש לתת תוספת של 0.3-0.5 גרם/ק"ג אורתן למינון כולל של 1.5 גרם/ק"ג.
הערה: כדי להכין את תמיסת האורתן 0.5 גרם / מ"ל, הוסף 10 גרם של אורתן ל -10 גרם (~ 10 מ"ל) של מלח. אורתאן הוא חומר מסרטן ויש לטפל בו בזהירות. עם זאת, זהו חומר הרדמה חשוב, שכן הוא אינו משנה את רמות הדופמין, כמו גם חומרי הרדמה אחרים כגון קטמין/קסילזין וכלורל הידרט.
- ברגע שבעל החיים מורדם עמוקות ואינו מגיב לגירויים מזיקים (למשל, צביטת בוהן), מקם אותו במסגרת הסטריאוטקסית. החל חומר סיכה אופתלמי על כל עין של חולדה.
הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדותי, אך מעודדים טכניקה אספטית טובה.
- נקו את הקרקפת של החולדה באמצעות פילינג דו-שלבי (כלומר, פילינג יודופובידון ואחריו פילינג אתנול 70%; בצעו עם חזרה של 3 מחזורים).
- חתכו את רקמת הקרקפת באמצעות מחט מעוקרת, פינצטה לאף, ומספריים כירורגיים. הסר כמות משמעותית של רקמה כדי לפנות מקום להשתלות השונות המתוארות להלן.
- נקו בעדינות את משטח הגולגולת באמצעות אפליקטורים מעוקרים של קצה כותנה. לאחר מכן יש למרוח 2-3 טיפות של 3% מי חמצן כדי לסייע בזיהוי הלמבדה והברגמה.
- באמצעות מקדחה סטריאוטקסית או ידנית (1.0 מ"מ, ~20,000 סל"ד), קדח חור בקוטר 1.5 מ"מ 2.5 מ"מ קדמי לברגמה ו-3.5 מ"מ רוחבי לברגמה. באופן חלקי (בערך באמצע הדרך, עד שהוא יציב במקומו) משתילים בורג (1.59 מ"מ O.D., 3.2 מ"מ אורך) בחור זה. מומלץ להשתמש במי מלח סטריליים להשקיה בזמן הקידוח כדי למנוע פגיעה תרמית.
- עבור אלקטרודת הייחוס, קדח חור בקוטר 1.0 מ"מ 1.5 מ"מ קדמי ו 3.5 מ"מ לרוחב לברגמה, בהמיספרה השמאלית.
- ביד, הכנס ~ 2 מ"מ של חוט ייחוס לתוך חור זה תוך כריכת חוט הייחוס סביב ומתחת לראש הבורג המושתל.
- השתיל את הבורג במלואו, והצמיד את אלקטרודת הייחוס למקומה.
- בהמיספרה הימנית, קדח חור בקוטר 1.5 מ"מ קדמי 1.2 מ"מ ורוחבי 1.4 מ"מ לברגמה.
- מוציאים בעדינות את הדורה בעזרת פינצטה.
- עבור האלקטרודה המעוררת, קדח חור מרובע (2 מ"מ קדמי-אחורי, 5 מ"מ מדיאלי-לטרלי) שבמרכזו 5.2 מ"מ אחורי ו-1.0 מ"מ רוחבי לברגמה.
- באמצעות מוטות הזרוע הסטריאוטקטיים, הורידו את האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית/צינורית ההנחיה 5 מ"מ מתחת לדורה. במקרה של דימום במהלך השתלת האלקטרודה, השתמש בצמר גפן סטרילי וגזה כדי למזער את הדימום.
הערה: האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית המשמשת בשיטה זו מצוידת בצינורית מנחה (טבלה של חומרים). הצינורית הפנימית המשמשת עם פריט זה צריכה להיות סמוקה עם השיניים על האלקטרודה המגרה דו קוטבית כאשר מוכנס במלואו לתוך צינורית המנחה. זה יאפשר לצינורית הפנימית לשבת ישירות בין שתי השיניים של המגרה, שיושבות במרחק של כ -1 מ"מ זו מזו. פרוטוקול דומה מתואר במקום אחר.
- באמצעות מוטות הזרוע הסטריאוטקטיים, הורידו את מיקרואלקטרודת סיבי הפחמן 4 מ"מ מתחת לדורה. מיקום זה נמצא בחלק הגבי ביותר של הסטריאטום.
- חבר את חוט הייחוס וסיבי הפחמן לפוטנציוסטט.
- החל צורת גל משולשת ( -0.4−1.3 V, 400 V/s) למשך 15 דקות ב- 60 הרץ, ושוב למשך 10 דקות ב- 10 Hz.
הערה: בדרך כלל, בעת החלת צורות גל על מיקרואלקטרודות של סיבי פחמן במוח, קבוצות תחמוצת מתווספות לפני השטח של סיבי הפחמן. יש להגיע לשיווי משקל של תגובה זו לפני ההקלטה; אחרת, יתרחש סחף משמעותי19. מחזור האלקטרודה בתדרים גבוהים יותר (60 הרץ) מאפשר לסיבי הפחמן להגיע לשיווי משקל מהר יותר.
3. אופטימיזציה של סיבי פחמן וגירוי מיקומי צינורית אלקטרודה/מנחה
- הגדר את הממריץ לייצר צורת גל חשמלית דו קוטבית, עם תדר של 60 הרץ, 24 פולסים, זרם 300 μA ורוחב פולס של 2 אלפיות השנייה לפאזה.
- מנמיכים בעדינות את הממריץ במרווחים של 0.2 מ"מ מ-5 מ"מ ל-7.8 מ"מ מתחת לדורה. בכל הפרש, לעורר את VTA.
הערה: בעומקים גביים יותר (5-6 מ"מ), גירוי המוח יגרום בדרך כלל (~80% מהזמן) לשפם של החולדה להתעוות. בעומקים נוספים, השפם יפסיק להתעוות, המתרחש בין 7.5-8.2 מ"מ מתחת לדורה. כאשר השפם מפסיק להתעוות, האלקטרודה המגרה תהיה ליד או ב- VTA. זה לא יקרה בכל חולדה, ואין לראות בעוויתות שפם סימן לכך שצינורית האלקטרודה/עירוי המגרה את הדו-קוטביות אינה במקומה. עוויתות שפם עשויות שלא להתרחש עבור כל חומרי ההרדמה (למשל, isoflurane).
- המשך להוריד את האלקטרודה המגרה הדו-קוטבית/צינורית ההנחיה עד שגירוי מייצר שחרור DA פאזי במיקרואלקטרודה מסיבי פחמן (כרגע בסטריאטום הגבי).
הערה: שחרור DA בסטריאטום הגבי לא תמיד יתרחש אם האלקטרודה הדו-קוטבית מושתלת ב-VTA, אך תצפית על שחרור DA בסטריאטום הגבי לאחר גירוי VTA היא בדרך כלל סימן טוב לכך שייצפה אות טוב בליבת NAc.
- מנמיכים את המיקרואלקטרודה מסיבי פחמן עד שהיא לפחות 6.0 מ"מ מתחת לדורה. זהו החלק הגבי ביותר של ליבת NAc.
- לעורר את VTA ולהקליט את משרעת השיא של שיא DA.
- הנמיכו או הרימו את המיקרואלקטרודה מסיבי פחמן באתר שמייצר את שחרור ה-DA הגדול ביותר.
- ודא ששיא תגובת DA הוא שיא חמצון ברור ב- 0.6 V ושיא הפחתה ב- -0.2 V. פסגות אלה מצביעות על DA.
4. עירוי וגירוי משולב הקלטת FSCV
הערה: איור 1 מראה את ציר הזמן להקלטה לפני ואחרי מיקרו-עירוי VTA.
- לאחר אופטימיזציה של סיבי הפחמן ומיקום האלקטרודה המגרה / צינורית המנחה, יש לעורר במשך ~20-30 דקות.
הערה: תחת פרמטרי הגירוי הנוכחיים, אין לגרות יותר מפעם אחת בכל 3 דקות, כדי לאפשר טעינה מחדש של שלפוחית השתן22.
- לאחר השגת קו בסיס יציב (<20% שונות על פני חמישה גירויים), הורידו בעדינות את הצינורית הפנימית ביד לתוך הצינורית המנחה המותאמת לממריץ הדו-קוטבי.
- קח עוד 2-3 הקלטות בסיסיות כדי לוודא שהחדרת הצינורית עצמה לא שינתה את האות המעורר. במקרים מסוימים, החדרה והסרה של הצינורית הפנימית עלולה לפגוע ב- VTA. אם האות משתנה באופן דרסטי במהלך תקופת בסיס זו (>20%), בצע הקלטות נוספות של 3-4 עד שקו הבסיס יתייצב מחדש.
- באמצעות משאבת מזרק ומזרק מיקרו, להחדיר 0.5 מיקרוליטר של תמיסה (למשל, 0.9% מלוחים, N-methyl-D-aspartate [NMDA], (2R)-amino-5-phosphonovaleric acid [AP5]) לתוך VTA במשך 2 דקות.
- לאחר העירוי, להשאיר את הצינורית הפנימית לפחות 1 דקות לפני ההסרה.
הערה: תרופות מסוימות עשויות לדרוש השארת הצינורית הפנימית למשך זמן רב יותר בהתבסס על קינטיקה של התרופה, והסרת הצינורית הפנימית עלולה לגרום לתרופה לנוע חזרה למעלה דרך הצינורית הפנימית. אם יש חשש, אפשר להשאיר את הצינורית הפנימית בצינורית המנחה במהלך כל ההקלטה. אחרת, ההקלטה יכולה להתחיל לאחר מרווח זה של דקה.
- המשך להקליט כל 3 דקות כדי למדוד את ההשפעות שלאחר העירוי.
הערה: אם מחדירים תמיסת בקרה, ולא נצפתה השפעה, ניתן להחדיר פעם שנייה10. אם יש שינוי בשחרור DA שנגרם על ידי החדרת הצינורית הפנימית או עירוי מי מלח, האות בדרך כלל מתאושש לקו הבסיס תוך 30 דקות.
