קביעת השפעת הורמון גדילה לבדיקה על נוירונים של קיספפטין באמצעות מהדק תיקון של תא שלם

תקציר

מקור: Silva, J. d. N., et al., נוירוני קיספפטין היפותלמוסיים כמטרה להקלטות מהדק טלאי של תא שלם. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים את השימוש בטכניקת מהדק טלאי תא שלם למדידת תגובות בתאי עצב קיספפטין מפרוסות היפותלמוס של עכבר. התהליך כולל השגת תצורת תא שלם ורישום שינויים פוטנציאליים בממברנה הנגרמים על ידי הורמון הבדיקה באמצעות מצב מהדק זרם.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. איטום תאים להקלטה

1. ודא שכל חלקי הציוד (מיקרוסקופ, amplifier, digitizer, micromanipulator ואחרים) מופעלים לפני תחילת ההקלטה.
2. מלא את תא ההקלטה, ממותג מסחרי ( Table of Materials), חבר למיקרוסקופ עם תמיסת aCSF להקלטות. השתמש במשאבת זלוף כדי לחלחל כל הזמן את ה-aCSF בקצב של 2 מ"ל/דקה.
3. העבירו פיסת מוח מעניינת (אחת בכל פעם) לחדר ההקלטה. השתמש בפיפטה העברה אקרילית (פיפטת זכוכית פסטר הפוכה המחוברת לפטמת סיליקון) כדי להעביר את פרוסות ההיפותלמוס לתא. השתמש בעוגן פרוסה ( Table of Materials) כדי להחזיק את הפרוסה כך שהיא לא תזוז במהלך הזלוף של aCSF.
4. הנח פרוסה במרכז תא ההקלטה המחובר למיקרוסקופ. מיקום הפרוסה הוא קריטי כדי לאפשר תצוגה טובה של האזור הרצוי מתחת למיקרוסקופ ולהגעה מושלמת של המיקרופיפטה ההקלטה.
5. השתמש בעדשת האובייקט בעלת ההספק הנמוך של מיקרוסקופ טבילה (10x או 20x) כדי לסייע במיקום הפרוסה ובאיתור אזור העניין.
6. לאחר איתור אזור העניין, החלף את עדשת האובייקט לעדשה בעלת העוצמה הגבוהה (63x) והתמקד ברמת הרקמה, תוך התבוננות בחלבון הפלואורסצנטי האנדוגני ובצורות התאים באזור המטרה כדי לאתר את תאי הקיספפטין על פני פרוסת המוח.
7. כאשר נמצא תא יעד אפשרי, סמן אותו על מסך המחשב באמצעות סמן העכבר או על ידי ציור פורמט, כמו ריבוע, מעל אזור העניין. סימן מסך המחשב עוזר לכוון את מיקום המיקרו-פיפטה המקליטה לתא.
8. לאחר קביעת המיקום המדויק של תא המטרה, הרם את המטרה והכנס את המיקרו-פיפטה המקליטה המלאה בתמיסה הפנימית. בעת הנחת המיקרופיפטה במחזיק האלקטרודה, ודא שהתמיסה הפנימית נמצאת במגע עם אלקטרודת הכסף.
   הערה: להכנה, מיקום ומיקום מיקרופיפטה על מחזיק האלקטרודה.
9. הפעל לחץ חיובי לפני טבילת המיקרופיפטה בתמיסת ה-aCSF, כדי למנוע כניסת פסולת למיקרופיפטה, באמצעות מזרק מלא אוויר בנפח 1-3 מ"ל המחובר למחזיק המיקרופיפטה דרך צינור פוליאתילן (≈130 ס"מ יותר); החל כמעט 100-200 מיקרוליטר אוויר.
10. בעזרת המיקרומניפולטור, הנח את המיקרו-פיפטה מתחת למרכז המטרה. הזז את הכפתורים במיקרומניפולטור כדי להנחות את המיקרופיפטה על ציר XYZ לעבר התא המבוקש.
11. כוונן את המיקוד כדי לראות את קצה המיקרופיפטה ולקרב את המיקוד, אך לא קרוב מדי, לפרוסה. הפחת את מהירות המיקרומניפולטור והורד לאט את המיקרופיפטה למישור המיקוד. ודא שקצה המיקרופיפטה אינו חודר בפתאומיות לפרוסה, אלא יורד לאט עד שהוא נוגע במשטח התא/אזור המטרה.
12. הפעל לחץ חיובי קל (≈100 מיקרוליטר) עם המזרק המלא באוויר של 1-3 מ"ל המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי לפנות כל פסולת מנתיב הגישה.
13. התמקדו בתא המטרה והזיזו לאט את המיקרומניפולטור על ציר ה-XYZ כדי לקרב את המיקרו-פיפטה אליו. כאשר נוגעים במיקרופיפטה בתא, תיצפה גומה שנגרמת על-ידי הלחץ שמופעל דרך קצה המיקרופיפטה (איור 2C).
14. לאחר יצירת הגומה, בשל קרבתה של המיקרופיפטה לתא, יש להפעיל יניקה חלשה וקצרה דרך הפה (1-2 שניות) דרך הצינור המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי ליצור את האיטום בין המיקרופיפטה לתא (חותם ג'יגה-פיפטה או ג'יגה-סיל >1 GΩ; איור 2D). כדי ליצור את החותם, השתמש במצב מהדק המתח בתוכנה.
15. אם האיטום נשאר יציב (אטם הג'יגה-אום צריך להיות יציב מכנית וללא הפרעות רעש, שנקבע על ידי תצפית למשך כדקה), הגדר את מתח ההחזקה בפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי הקרוב ביותר של התא המעניין. עבור נוירונים היפותלמוסיים של קיספפטין, מומלץ -50 mV.
16. הפעילו שאיבה קצרה דרך הפה (לחץ שלילי) כשהמיקרו-פיפטה אטומה לתא כדי לשבור את ממברנת הפלזמה (איור 2E). תצורה נאותה של תא שלם מושגת כאשר היניקה מתבצעת בכוח מספיק כדי שהקרום הקרוע לא יסתום את המיקרופיפטה ולא ימשוך חלק ניכר מהממברנה או אפילו מהתא.
17. בדוק את מדריך הגדרות המערכת שבו נעשה שימוש. השתמש בתוכנה (ראה טבלת חומרים) כדי לבדוק ולחשב דיגיטלית את ההתנגדות הטורית (SR) ואת קיבול התא השלם (WCC).
18. במצב מהדק מתח, לאחר שבירת קרום התא, הפעל את אפשרות התא כולו ולחץ על הפקודה האוטומטית המתייחסת לכרטיסיית התא כולה. ה-SR וה-wcc של התא יחושבו אוטומטית ויוצגו באופן מיידי על ידי התוכנה. ניתן לבדוק פרמטרים אלה גם על ידי ביצוע בדיקת הממברנה עם המגבר המוזכר בטבלת החומרים.
19. הקפד לבדוק את פרמטרי הכדאיות של התא. עבור נוירונים של קיספפטין, בדוק שהמדידות האלקטרופיזיולוגיות הן: SR < 25 mΩ, התנגדות כניסה > 0.3 GΩ והחזקת ערך מוחלט של זרם < 30 pA. הערך הממוצע של ה-WCC של תאי העצב AVPV/PeNKisspeptin או ARHkisspeptin הוא ≈-10-12 pF בעכברים שלמים עם בלוטת המין.
20. עקוב אחר ה-SR וקיבול המצב היציב של התא במהלך הניסויים. ודא שה-SR אינו משתנה יותר מ-20% במהלך הקלטה ושקיבול הממברנה יציב.
21. בדוק את הגדרות התוכנה. צור פרוטוקולים ספציפיים להקלטות בהתאם לסוג הניסוי. כדי לתעד את פוטנציאל הממברנה במצב מהדק זרם, עם ציוד המוזכר בטבלת החומרים, מעביר נמוך מסנן את האותות האלקטרופיזיולוגיים ב-2-4 קילו-הרץ ומנתח את התוצאות במצב לא מקוון בתוכנה (ראה טבלת החומרים למידע על התוכנה).
22. לאחר שתצורת התא השלם מושגת כראוי, מדוד זרמים סינפטיים במצב מהדק מתח (איור 2G). רשום שינויים בפוטנציאל הממברנה במנוחה (RMP) ושינויים מושרים ב-RMP במצב מהדק זרם (איור 2H). שינויים ב-RMP, כמו למשל דה-פולריזציה של קרום התא, יכולים להיגרם על ידי מתן תרופה/מוליך עצבי ידוע לאמבטיה (מתואר בשלב 1.2), כפי שמוצג באיור איור 1.
    הערה: במצב מהדק זרם, ניתן להזריק זרם חיובי או שלילי כדי להחזיק את מתח הממברנה במתח הרצוי. עבור נוירונים של קיספפטין, אנו בדרך כלל מגדירים הזרקת זרם אפס (I = 0) כדי לתעד את השונות הספונטנית של פוטנציאל הממברנה.

תוצאות

איור 1: דיאגרמה סכמטית המסכמת את התרומה של טכניקת מהדק התיקון של התא השלם לידע על פעילות תאי העצב של הקיספפטין. נוירונים של קיספפטין (מוצגים בירוק) ממוקמים בגרעינים הפרי-חדריים הקדמיים והרוסטרליים (AVPV/PeN) ובגרעין הקשת של ההיפותלמוס (ARH). תאי AVPV/PeNKisspeptin ו-ARHkisspeptin שולחים קשרים ישירים לנוירונים של הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH) הממוקמים באזור הקדם-אופטי (POA) ולטרמי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תרכובות עבור aCSF, פתרונות פנימיים ופתרונות חיתוך
ATP	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	A9187
סידן כלורי	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	C7902
D-(+)-גלוקוז	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	G7021
EGTA	סיגמא אולדריץ'/שונים	O3777
HEPES	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	H3375
KCl	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	P5405
K-גלוקונאט	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	G4500
KOH	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	P5958
מגנזיום כלוריד	סיגמא אולדריץ'/שונות	M9272
מגנזיום גופרתי	סיגמא אולדריץ'/שונות	230391
NaCl	סיגמא אולדריץ'/אמנים שונים	S5886
מונוסודיום פוספט	סיגמא אולדריץ'/שונות	S5011
נתרן ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'/שונים	S5761
ציוד
מגבר	התקנים מולקולריים	Multiclamp 700B
מערכת רכישת נתונים DIGIDATA 1440 עם רעש נמוך	התקנים מולקולריים	DD1440
משאבה פריסטלטית דיגיטלית	איסמטק	ISM833C
כלוב פאראדיי	TMC	81-333-03
מצלמת הדמיה	לייקה	DFC 365 FX
מיקרומניפולטור	Sutter Instruments	Roe-200
חולץ מיקרופיפטה	Narishige	PC-10
מיקרוסקופ	לייקה	DM6000 FS
תא שחזור	מכשירי וורנר אינסטרומנטס/הרווארד	-
תא הקלטה	וורנר אינסטרומנטס	640277
מרית	פישר סיינטיפיק /שונים	דג-14-375-10; דג-21-401-20
תוכנה ומערכות
תוכנת AxoScope 10	התקנים מולקולריים	-	תוכנת קומנדר
מערכת שדות רחבים LAS X	לייקה	-	רכישת תמונות וניתוחן
MultiClamp 700B	התקנים מולקולריים	מולטי-מהדק 700B	תוכנת קומנדר
תוכנת PCLAMP 10 עבור WINDOWS	התקנים מולקולריים	מהדק 10 סטנדרטי
כלים
אלקטרודת Ag/AgCl, גלולה, 1.0 מ"מ	וורנר אינסטרומנטס	64-1309
עוגן פרוסה	וורנר אינסטרומנטס	64-0246