הערכה מבוססת מערך מיקרואלקטרודות של רשתות עצביות בפרוסות חוט השדרה של עכבר

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. אלקטרופיזיולוגיה חוץ גופית

1. הכנת פתרונות להכנת ורישום פרוסת חוט השדרה
   1. נוזל מוחי מלאכותי
      הערה: נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) משמש בתא דגירה ממשק, שבו פרוסות מאוחסנות עד תחילת ההקלטה ובמהלך ניסויים הן כמבלבלים והן מדללים לתרופות. ראו טבלה 1 להרכב המפורט.
2. הכינו aCSF המכיל (במ"מ) 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 גלוקוז, 2.5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ ו-2.5 CaCl₂ על ידי הוספת הכמויות הנדרשות של הנ"ל, למעט CaCl₂, ל-2 ליטר מים מזוקקים.
3. בוערו את התמיסה הנ"ל עם קרבוגן (95% O₂, 5% CO₂) למשך 5 דקות והוסיפו CaCl₂.
   הערה: שלב זה מונע משקעים CaCl₂, כלומר, הפתרון לא צריך להפוך מעונן. ליישום תרופות במהלך ניסויים, דללו את תמיסות מלאי התרופות ב- aCSF לריכוזים הסופיים הרצויים.

2. נוזל מוחי מלאכותי תחליפי סוכרוז

הערה: aCSF תחליפי סוכרוז משמש במהלך דיסקציה וחיתוך חוט השדרה. כפי שצוין על ידי השם, סוכרוז מוחלף NaCl כדי להפחית עירור עצבי במהלך הליכים אלה תוך שמירה על אוסמולריות. ראו טבלה 1 להרכב המפורט.

1. הכינו aCSF תחליפי סוכרוז המכיל (במ"מ) 250 סוכרוז, 25 NaHCO₃, 10 גלוקוז, 2.5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ ו-2.5 CaCl₂ על ידי הוספת הכמויות הנדרשות מכל האמור לעיל, למעט CaCl₂, ל-300 מ"ל מים מזוקקים.
2. מבעבעים את התמיסה עם קרבוגן למשך 5 דקות ולאחר מכן מוסיפים CaCl₂.
3. אחסנו את התמיסה במקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך כ-40 דקות או עד שהתמיסה יוצרת תרחיץ. יש להימנע מהקפאת מוצק ולהשתמש במרקם של תרחיץ.

3. הכנת מערך מיקרואלקטרודות

הערה: משטח המגע של MEA דורש טיפול מקדים כדי להפוך אותו הידרופילי.

1. לפני הניסוי, מלא היטב את MEA בסרום בקר עוברי (FBS) או בסרום סוס (HS) למשך 30 דקות.
2. הסר את FBS או HS ושטוף ביסודיות MEA עם כחמש שטיפות של מים מזוקקים עד שהמים המזוקקים כבר לא מוקצפים. מלא את הבאר עם aCSF, מוכן לשימוש.

4. הכנת פרוסת חוט שדרה חריפה

1. הרדימו את העכבר עמוקות עם 100 מ"ג/ק"ג קטמין (כלומר) ולאחר מכן ערפו את ראשו באמצעות מספריים כירורגיים גדולים.
2. הסר את העור מעל אזור הבטן על ידי ביצוע חתך קטן בעור בגובה הירכיים. משכו את העור משני צדי החתך עד להסרת כל העור, כלומר מראש כלוב הצלעות ועד לחלק העליון של האגן (הן בגחון והן בגב).
3. הניחו את הגוף על קרח והשתמשו בגישה גחונית כדי לחשוף את עמוד השדרה על ידי הסרת כל הקרביים וחיתוך דרך הצלעות לרוחב עצם החזה.
4. הסירו את כלוב הצלעות הגחוני, הן את עצם השכמה (נחתכה בערך ב-T2), והן את הגפיים התחתונות והאגן (חתוכים בערך בחלק העליון של העצה).
5. מעבירים את עמוד השדרה ואת הכנת הצלעות לאמבט נתיחה המכיל סוכרוז קר כקרח aCSF. הצמידו את כל ארבע פינות התכשיר (משטח הגחון כלפי מעלה) על ידי הנחת סיכות דרך שרירי הגב התחתון והצלעות העליונות המצורפות.
6. הסר את כל השרירים ורקמת החיבור מעל פני השטח הגחוני של החוליות עם רונג'ורים וזהה את אזור החוליות מעל ההגדלה המותנית, הנמצאת בערך מתחת לגופי החוליות T12 עד L2.
7. הסר גוף חוליה שהוא קאודלי לאזור ההגדלה המותנית כדי לספק גישה לחוט השדרה כשהוא יושב בתעלת החוליות.
8. באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים, חותכים דרך פדיקור החוליות באופן דו צדדי תוך הרמה ומשיכה של גוף החוליה באופן רוסטרלי כדי להפריד בין ההיבטים הגחונים והגביים של החוליות ולחשוף את חוט השדרה.
9. לאחר הסרת גופי החוליות כדי לחשוף את ההגדלה המותנית, נקה בזהירות את השורשים הנותרים המעגנים את חוט השדרה במספריים קפיציים עד שהחוט צף חופשי.
10. בודד את חוט השדרה עם חתכים רוסטרליים וקאודליים הרבה מעל ומתחת להגדלה המותנית, ומאפשר לאזור המטרה של החוט 'לצוף חופשי'
    הערה: כיוון הפרוסה המועדף יקבע כיצד הכבל יותקן לאחר מכן לצורך חלוקה (איור 1).
11. לפרוסות רוחביות, הרימו את המקטע המותני בשורש מחובר והניחו אותו על גוש פוליסטירן (קלקר) חתוך מראש (1 ס"מ x 1 ס"מ x 1 ס"מ) עם תעלה רדודה חתוכה במרכז. השתמש בדבק ציאנואקרילט (ראה טבלת חומרים) כדי לחבר את הבלוק והחוט למשטח החיתוך והניחו אותו באמבט חיתוך המכיל סוכרוז קר כקרח aCSF (slurry).
    הערה: התעלה הרדודה מסייעת לאבטח ולכוון את חוט השדרה, כאשר הצד הגבי חשוף והקצה החזי של החוט נמצא בתחתית הבלוק.
12. עבור פרוסות קשת, הניחו קו דק של דבק ציאנואקרילט על משטח החיתוך, הרימו את ההגדלה המותנית על ידי שורש מחובר, והניחו את החוט לאורך קו הדבק, תוך הקפדה על משטח רוחבי אחד בדבק והשני פונה כלפי מעלה. הניחו אותו באמבט חיתוך המכיל סוכרוז קר כקרח aCSF (slurry).
13. לפרוסות אופקיות, הניחו קו דק של דבק ציאנואקרילט על משטח החיתוך. הרימו את ההגדלה המותנית על ידי שורש מחובר, והניחו את ההגדלה המותנית לאורך קו הדבק, תוך הקפדה על כך שמשטח הגחון נמצא בדבק והמשטח הגבי פונה כלפי מעלה. השתמש בשורשים מחוברים כדי למקם את הכבל. הניחו אותו באמבט חיתוך המכיל סוכרוז קר כקרח aCSF (slurry).

5. הקלטות מערך מיקרואלקטרודות

הערה: השלבים הבאים מפרטים כיצד להשתמש בנתוני רשומות מניסויים מבוססי MEA על פרוסות חוט השדרה. ניתן להשתמש במספר עיצובי MEA בהתאם לניסוי. פרטי התכנון של MEAs ששימשו בניסויים האלה מוצגים בטבלה 2 ובאיור 2. מידע תכנון מפורט פורסם על ידי Egert et al. ו- Thiebaud et al. עבור MEA מישורי ותלת ממדי (3D), בהתאמה. שני סוגי MEA מורכבים מ-60 אלקטרודות טיטניום ניטריד, עם שכבת בידוד סיליקון ניטריד ומסילות טיטניום ניטריד ורפידות מגע.

1. מערך ניסיוני
   1. הפעל את המחשב ואת לוח הממשק, והפעל את תוכנת ההקלטה.
   2. טען את תבנית ההקלטה שהורכבה מראש (איור 3A). תן שם לקבצים עבור היום בכרטיסייה מקליט.
   3. מבעבעים ברציפות aCSF עם קרבוגן (5% CO₂, 95% O₂) למשך הניסוי.
   4. הפעל את מערכת הזילוח, הנשלטת על ידי משאבה פריסטלטית. מקם את קו הכניסה לתוך aCSF ואת קצה הכניסה בכוס פסולת. הפריזו את קווי הזילוח עם aCSF.
   5. הכינו 4-AP וכל פתרון תרופתי אחר על ידי דילול מלאי ב-50 מ"ל של aCSF לריכוז הסופי הנדרש (למשל, 200 מיקרומטר עבור 4-AP).
2. פעילות 4-aminopyridine (4-AP)
   1. לאחר הדגירה מעבירים פרוסה בודדת מהאינקובטור באמצעות פיפטת פסטר גדולה מלאה ב-aCSF.
   2. מניחים את הפרוסה היטב MEA ולהוסיף aCSF נוסף.
   3. מקמו את הפרוסה מעל מערך ההקלטה בן 60 האלקטרודות באמצעות מברשת צבע עדינה לשיער קצר. הימנע ממגע עם האלקטרודות עם המברשת או גרירת הרקמה על פני האלקטרודות, במיוחד אם אתה משתמש במערכים תלת-ממדיים.
      הערה: בהתאם לפריסת MEA, ניתן לעשות זאת עם או בלי סיוע של מיקרוסקופ למיקום מדויק.
   4. לאחר מיקום הפרוסה, הניחו רשת משוקללת על הרקמה כדי להחזיק אותה במקומה ולקדם מגע טוב עם אלקטרודות MEA.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את הפרוסה לאחר מיקום הרשת.
   5. מקמו את ה-MEA בכותרת ההקלטה (איור 2A, B).
   6. בדוק את מיקום הרקמה מעל האלקטרודות באמצעות מיקרוסקופ הפוך (הגדלה פי 2) כדי לוודא שכמה שיותר אלקטרודות נמצאות מתחת לקרן הגבי השטחי (SDH). ודאו שלפחות 2-6 אלקטרודות לא באות במגע עם הפרוסה מאחר שהאלקטרודות האלה חשובות לחיסור רעש ולהקלטת חפצים במהלך הניתוח (איור 2E).
   7. הפעל את המצלמה, חבר אותה להתקן וצלם תמונת ייחוס של הפרוסה ביחס ל- MEA לשימוש במהלך הניתוח.
   8. לחץ על Start DAQ (Data acquisition) בתוכנת ההקלטה וודא שכל האלקטרודות מקבלות אות ברור.
      הערה: אם האות רועש, בטל את החיתוך של במת הראש ונקה הן את רפידות המגע MEA והן את מגעי קפיץ הזהב עם 70% אתנול (השתמש במגבון מעבדה כדי להבטיח שהרפידות והמגעים יבשים לאחר הניקוי). אם האות עדיין רועש, כבה את האלקטרודות התקלות בתוכנת ההקלטה או רשום את ההרחקה מאוחר יותר במהלך הניתוח.
   9. חבר את קווי הכניסה והשקע של הזלוף לבאר MEA (שמולאה בעבר ב- aCSF) והפעל את מערכת הזילוח. בדוק את קצב הזרימה, באופן אידיאלי 4-6 נפחי אמבטיה לדקה, וודא כי הזרימה החוצה מספיקה כדי למנוע הצפה של superfusate.
   10. אפשר לרקמה להתאזן למשך 5 דקות ולאחר מכן הקלט 5 דקות של נתונים בסיסיים גולמיים ולא מסוננים.
   11. העבר את קו כניסת הזלוף מ- aCSF לתמיסת 4-AP והמתן 12 דקות עד שהפעילות הקצבית המושרה על ידי 4-AP תגיע למצב יציב (2 דקות לתרופות להגיע לאמבטיה ו- 10 דקות עד שהפעילות תגיע לשיא ואז למישור).
   12. הקלט 5 דקות של פעילות הנגרמת על ידי 4-AP. היו מוכנים להקלטות הבאות כדי לבדוק את התרופות או כדי לבדוק את היציבות של 4-AP.

טבלה 1: הרכבי נוזל מוחי מלאכותי.

טבלה 2: פריסות מערך מיקרואלקטרודות.

איור 1: כיווני פרוסות חוט השדרה, שיטות הרכבה וחיתוך. (A) פרוסות רוחביות דורשות גוש חיתוך קלקר עם חריץ תומך חתוך לתוכו. חוט השדרה מונח כנגד הבלוק בחריץ התמיכה, הצד הגבי של החוט פונה הרחק מהבלוק. הבלוק והחוט מודבקים על שלב חיתוך עם דבק ציאנואקרילט. (B) מכינים פרוסות קשת על ידי הנחת קו דק של דבק ציאנואקרילט על שלב החיתוך ולאחר מכן מיקום חוט השדרה על צידו על הדבק. (C) פרוסות אופקיות מוכנות על ידי הנחת קו דק של דבק ציאנואקרילט על שלב החיתוך ולאחר מכן מיקום הצד הגחוני של חוט השדרה כלפי מטה על הדבק.

איור 2: מיקום רקמות על מערך המיקרואלקטרודות. (A) התמונה מציגה במת MEA פתוחה עם MEA ממוקם במקומו. (B) זהה ל-A עם במת MEA סגורה להקלטות ומערכת זילוח רקמות במקום. (C) התמונה מציגה MEA כפי שסופק על-ידי היצרן. רפידות מגע, המתממשקות עם קפיצי הזהב של במת הראש, ואמבט רקמות MEA המחזיק את תמיסת הרחצה הרקמה ואת פרוסת הרקמה מוצגים. האזור המודגש על ידי הריבוע האדום במרכז הוא המיקום של מערך האלקטרודות. (D) סכמות מראות את שתי תצורות אלקטרודות MEA ששימשו במחקר זה, עם פרטים נוספים המוצגים בטבלה 2. אלקטרודת הייחוס מסומנת בטרפז הכחול. פריסת אלקטרודות MEA השמאלית מציגה תצורה מרובעת של 60 אלקטרודות, המשמשת ביותר בדגמי העבודה המוצגים 60MEA200/30iR-Ti עם אלקטרודות בקוטר 30 מיקרומטר במרווחים של 200 מיקרומטר זו מזו, או 200 מיקרומטר ברווח ו- 100 מיקרומטר במרווחים תלת ממדיים (60MEA200/12/50iR-Ti ו- 60MEA100/12/40iR-Ti) עם אלקטרודות בקוטר 12 מיקרומטר ובגובה 50 מיקרומטר או 40 מיקרומטר, בהתאמה. פריסת אלקטרודת MEA השמאלית מציגה פריסה מלבנית של 6 x 10 אלקטרודות-60MEA500/30iR-Ti. (E) תמונה בהגדלה גבוהה של MEA מרובע 60MEA100/12/40iR-Ti עם פרוסת חוט שדרה רוחבית הממוקמת להקלטה. הפרוסה יושבת על שורות אלקטרודות 3-8. השורה העליונה של האלקטרודות, שאינן נוגעות בשום רקמה, משמשות כאלקטרודות ייחוס. אזור SDH מופיע כפס שקוף למחצה. במקרה זה, ה-SDH מכסה אלקטרודות בשורות 4, 5 ו-6 ובעמודות 2, 3, 4, 5 ו-7 של MEA. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: MEA = מערך מיקרואלקטרודות; SDH = קרן גבית שטחית.

איור 3: פריסות כלי הקלטה וניתוח נתונים והקלטות לדוגמה של מערך מיקרואלקטרודות המציגות פוטנציאל פעולה חוץ-תאי וצורות גל פוטנציאליות של שדה מקומי. (A) סכמטי מציג תבנית הקלטה מוגדרת מראשהמשמשת לרכישת נתוני MEA. קישור כלי MEA2100 וההקלטה (headstage/amplifier) מאפשר לתת שם לנתונים ולשמור אותם. ארבע עקבות לדוגמה של נתונים גולמיים (מימין, תקופות של 5 דקות) נאספו על ידי ערוץ MEA אחד המציג פעילות בנקודת ההתחלה, 12 דקות לאחר יישום 4-AP, 15 דקות נוספות לאחר פעילות מבוססת של 4-AP, ולאחר יישום אמבטיה של TTX (1 מיקרומטר). שים לב, התוספת של 4-AP (מעקב שני) מייצרת עלייה ברורה ברעשי רקע ובפעילות EAP/LFP. חשוב לציין, הפעילות נשארת יציבה יחסית למשך 15 דקות לפחות לאחר התבססות פעילות הנגרמת על ידי 4-AP (מעקב שלישי). הוספת TTX (1 מיקרומטר) מבטלת את כל הפעילות (עקבות תחתונות). (B) סכמטי (משמאל) מציג את תצורת תוכנת המנתח לניתוח נתונים. כלי סייר הנתונים הגולמיים משמש לייבוא הקלטות שנאספו על ידי תוכנת הקלטה. נתונים אלה רצים לאחר מכן באמצעות כלי סינון חוצה ערוצים שמחסיר את האותות של אלקטרודות הייחוס שנבחרו מאלקטרודות אחרות כדי להסיר רעשי רקע. הנתונים עוברים דרך מסנן EAP וכלי סינון LFP כדי למטב את קשרי האות לרעש עבור כל צורת גל. לאחר שלב זה, נתוני נתיב EAP נכנסים לכלי גלאי EAP, שבו נקבעים ערכי סף. EAPs מזוהים ולאחר מכן נשלחים לכלי EAP analyzer שבו השהיות של כל אירוע נרשמות ומיוצאות כ- txt. קובץ. זרימת עבודה זהה מתרחשת עבור נתוני LFP באמצעות ערכת כלים מתאימה של LFP. עקבות ימניים מציגות נתונים מערוץ MEA יחיד המכיל צורות גל חוץ-תאיות שונות. מיקום אותות EAP ו- LFP מודגשים ב'ספירת ראסטרים' לעיל. עקבות תחתונות הן תקופות מהקלטה עליונה (מסומנות בפסים אדומים) המציגות צורות גל בסקאלת זמן מורחבת, כולל אותות LFP שונים (שימו לב למגוון ההופעות) ו-EAPs חוץ-תאיים בודדים (עיגולים אדומים). שימו לב, צורת הגל והקוטביות של LFP/EAP משתנות ביחס למספר תאי העצב המפיקים אותות אלה, קרבתם לאלקטרודת ההקלטה ומיקומם ביחס לאלקטרודות הסמוכות. קיצורים: MEA = מערך מיקרואלקטרודות; EAP = פוטנציאל פעולה חוץ-תאי; LFP = פוטנציאל שדה מקומי; 4-AP = 4-aminopyridine; TTX = טטרודוטוקסין.