רישום שינויים בפעילות העצבים הסימפתטיים הכלייתיים בתגובה ללחץ עורקי בחולדות

תקציר

מקור: Fink, A. M., et al. כימות שינויים חריפים בפעילות עצבית סימפתטית כלייתית בתגובה למניפולציות במערכת העצבים המרכזית בחולדות מורדמות. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקה של חקר הפעילות של עצבים סימפתטיים כלייתיים (RSNs) בתגובה לשינויים בלחץ העורקי בחולדות. עם חיבור קטטר חישת לחץ לעורק הירך, העצבים הסימפתטיים של הכליה נחשפים. העצבים מורמים לאחר מכן על אלקטרודת הקלטה, והפעילות החשמלית שלהם נרשמת. לאחר מכן, תרופה vasoconstricting מוזרק כדי להעלות את לחץ הדם, ואת השינויים המתאימים בפעילות RSN מנוטרים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. יצירת אלקטרודות RSNA דו קוטביות

1. כדי ליצור את האלקטרודה, חתכו שתי חתיכות של חוט נירוסטה באורך של כ-18 מ"מ כל אחת. חתכו חתיכה אחת של צינור פוליאתילן (PE-50) באורך של כ-15 מ"מ. הזינו את שתי חתיכות החוט לתוך הצינור, ומשאירים את החוט בולט משני קצותיו.
2. הסר את הבידוד מקצות החוטים; חתוך את החוטים ומשאיר 2-3 מ"מ של חוט חשוף. בקצה אחד, מכווצים סיכות זכריות מעל החוט החשוף. הלחמת את הפינים היטב לחוט, לאבטח את הפינים בתוך רצועת מחבר ולכסות את החיבור עם epoxy.
   הערה: גישה חלופית הנמנעת מהלחמה היא להשתמש בתפסי תנין מהירים לחיבור/שחרור.
3. בקצה הנגדי של האלקטרודה, להסיר את הבידוד מקצות החוטים, משאיר 2-3 מ"מ של חוט חשוף. כופפו חלק זה של החוטים כדי ליצור ווים קטנים בצורת "V" בחוט הלא מבודד.
   הערה: זהו החלק של האלקטרודה שיהיה במגע עם העצב הסימפתטי של הכליה. חשוב לאטום קצה זה כדי למנוע כניסת נוזלים לצנרת. סיליקון או אפוקסי ביעילות ניתן להשתמש.

2. מתן הרדמה והכנת אתרי ניתוח

1. מתן הרדמה לחולדה זכר Sprague Dawley (גיל 9-11 שבועות, במשקל 150-400 גרם). מתן נתרן pentobarbital 50 מ"ג / ק"ג באמצעות הזרקה intraperitoneal (IP). כדי להעריך מישור יציב של הרדמה במהלך הניתוח, בדוק את רפלקס צביטת הבוהן כל 15 דקות והרדמה במינון חוזר לפי הצורך.
   הערה: נתרן Pentobarbital (Nembutal) שימש במחקרים קודמים כדי להשיג מישור מתמשך של הרדמה מבלי להפריע אפנון של RSNA. פרוטוקול זה מיועד לניתוח שאינו הישרדותי, ולכן אין תקופת החלמה/מעקב לאחר הניתוח.
2. הכינו את אתר הניתוח בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים (כלומר, גלחו את הבטן, הגב והראש של החולדה; נקו את העור בתמיסת 10% פובידון-יוד; מרחו חומר סיכה לעיניים; והניחו את החולדה על כרית חימום). שמור על טמפרטורת הגוף ב 37 ° C במהלך הניסויים.

3. לנטר את עורק הירך לצורך ניטור לחץ עורקים ממוצע

1. דמיינו את העורק מתחת למיקרוסקופ. בדומה לשיטה המשמשת לקנולציה ורידית, לקשור את התפר הדיסטלי כדי לחסום את העורק; הצמידו את שולי התפר לשדה הניתוחי בעזרת סרט משי ומקמו את העורק בניצב ליד הדומיננטית של המנתח.
2. גישה עורקית אם משתמשים בטלמטריה
   1. בדוק את צנתר חישת הלחץ תחת הגדלה גבוהה לפני קנולציה עורקית. יש לוודא שהקטטר נקי מבועות/פסולת ובעל מניסקוס שלם בין המרכיבים מלאי הנוזל (פרוקסימלי) ומלא הג'ל (דיסטלי). לפני כל השתלה, מלאו מחדש את הג'ל בקצה הדיסטלי של הצנתר. הפעל את המשדר באמצעות מגנט; לפקח על לחץ הדם (BP) במהלך הניתוח כדי לסבול מיקום מושלם.
   2. השתמש חצי קשר רופף בתפר הפרוקסימלי כדי לחסום לזמן קצר את עורק הירך. החזיקו את החדרת הצנתר ביד הלא דומיננטית. החזק את קצה הצינורית של יחידת הטלמטריה עם מלקחיים לקנולציית כלי דם כדי למנוע תזוזה של ג'ל מהקצה.
   3. נקבו חור בעורק עם מחט 22G הכפופה והכניסו את הצינורית לעורק באמצעות מלקחיים לקנולציית כלי דם כדי למנוע תזוזה של ג'ל מהקצה. מקדמים את הצינורית ככל האפשר. באמצעות קשרי התפרים הפרוקסימליים והדיסטליים, אבטחו את צנתר הלחץ.
   4. תוחבים את גוף שתל הטלמטריה בתוך האגף הסמוך לחתך וסוגרים חתך זה באמצעות תפר ניילון 4-0 על מחט חיתוך. כבה את מכשירי הטלמטריה באמצעות מגנט בסוף תקופת ההקלטה כדי לחסוך בחיי הסוללה.

4. מקמו את החולדה במסגרת הניתוח הסטריאוטקסי כדי לגשת למוח

1. העבירו בעדינות את החולדה למצב נוטה במסגרת הניתוח הסטריאוטקסי.
2. מקמו את החולדה בין מוטות האוזניים וכווננו את המוט החותך כדי להשוות את גובה הלמבדה והברגמה. המיקום עשוי להיות תלוי בזן החולדה, במשקל ובמיקומים של מטרות מערכת העצבים המרכזית (CNS).
3. בצע חתך אזמל rostrocaudal 2 ס"מ דרך קו האמצע של הקרקפת. באמצעות אפליקטורים כותנה, להסיר בחוזקה רקמת חיבור מפני הגולגולת. יש למרוח מי חמצן על הגולגולת כדי לסייע בהדמיה של התפרים של ברגמה, למבדה וקו האמצע.
4. בעזרת אטלס של מוח החולדה כדי להנחות את המטרה, קדחו אוסטאוטומיה של חור בור, בגודל המתאים לגישה לאלקטרודות, דרך הגולגולת.

5. בידוד העצבים הסימפתטיים של הכליה

1. חבר את אלקטרודת ה-RSNA החוטית (שלבים 1.1-1.3) לקדם-מגבר 10X ולמגבר מיקרואלקטרודות.
2. בודדו את עצבי הכליה דרך חתך רטרופריטוניאלי לפני, או אחרי, החולדה מאובטחת במסגרת הסטריאוטקסית. מקמו את אלקטרודות ה-RSNA ברגע שהחולדה נמצאת במסגרת הסטריאוטקסית. בצע חתך אזמל המשתרע מ 4-5 ס"מ מתחת לצלעות בכיוון קאודלי, מעט לרוחב לעמוד השדרה. בלאנט מנתח את החתך כדי לדמיין את השרירים הפאראספינליים.
3. השתמש מספריים לעשות חתך rostrocaudal שטחי מאוד 1-2 ס"מ שבו השומן פוגש את השריר. באמצעות אפליקטורים כותנה, להפיץ את השומן הרחק מן השריר כדי לדמיין את הכליה. חשוב לא להיכנס לחלל הצפק.
4. השתמש retractors כדי להפריד בעדינות את הכליה מן השרירים paraspinal כדי לדמיין את עורק הכליה ואת אבי העורקים הבטן. אין למתוח את כלי הדם יתר על המידה כדי למנוע פגיעה בעצבי הכליה. השתמש פד גזה כותנה 2" x 2" ספוג במי מלח כדי להגן על הכליה מפני פציעה.
5. תחת הגדלה גבוהה, לזהות את עצבי הכליה בכיס החתך. צרורות העצבים נראים בקלות רבה בזווית הישרה, הנוצרת על ידי אבי העורקים ועורק הכליה. עצבי הכליה עוקבים מקרוב אחר עורק הכליה מאבי העורקים ועד הכליות.
6. בחר קטע של צרור העצבים אשר יונח על אלקטרודת ההקלטה. נתחו בעדינות את סיבי העצב מהרקמה/כלי הדם שמסביב באמצעות פינצטה מיקרו-כירורגית.
7. אבטח את אלקטרודת ה-RSNA במחזיק (לדוגמה, תפס תנין המחובר למעמד תמיכה). הורידו את האלקטרודה לרמה של מקטע העצבים. השתמש בוו עצב כדי להרים בעדינות את המקטע של עצב הכליה על האלקטרודה מבלי למתוח את העצב.
   הערה: העצב צריך לנוח בתוך שני ווים בצורת "V" בחוט הלא מבודד, במקביל לעצב . אסור שחוטי האלקטרודות ייגעו ברקמה, דם או נוזל לימפה אחרים.
8. מלא את החתך בשמן מינרלי כדי למנוע מהעצב הסימפתטי הכליתי החשוף להתייבש. השתמשו בתפס הארקה עם קצה אחד על עור החתך והשני מחובר לכלוב פאראדיי.
9. כוון את האות למגברים באמצעות סינון מעבר גבוה ונמוך (10 הרץ ו- 3 קילוהרץ). כוונן את הרווח עד 10 K. כלול צג שמע כדי להעריך את דפוס ההתפוצצות של ה-RSNA. השתמש בקצבי דגימה הנעים בין 2,000-10,000 הרץ. השתמש בקצב דגימה מוגבר כאשר מניפולציה CNS משוערת לגרום לתגובות סימפתטיות מהירות/קצרות.

6. נתוני רשומה

1. להעריך את איכות הקלטת RSNA על ידי מעורר baroreflex עם הזרקת בולוס של 1 מ"ל של מלוחים או 10 מיקרוגרם / מ"ל phenylephrine (ב 0.1 מ"ל) תוך ורידי. כפי שמודגם באיור 1, העירוי אמור להגביר את BP ולעכב RSNA. עלייה בלחץ העורקים הממוצע של 60-80 מ"מ כספית מספיקה עבור סימפתוניטיביציה כלייתית.
2. התאם את מיקום האלקטרודות כדי לשפר את האות במידת הצורך. מיקום מחדש נדרש אם העצב אינו נמצא במגע עם שני הווים באלקטרודה או אם רקמה, דם או נוזל לימפה כלשהם נמצאים במגע עם החוטים.
   הערה: הצורך במיקום מחדש מבוסס על המאפיינים השמיעתיים של הפרשות העצבים.
3. לאחר קבלת אות ברור, אבטחו את אלקטרודת ה-RSNA במקומה על ידי משיכת שמן מינרלי ומריחת ג'ל סיליקה כדי לכסות את חיבור העצבים/אלקטרודות בכיס החתך. אין להזיז את החולדה לפני שהג'ל התייצב לחלוטין.
4. בצע פרוטוקולי מניפולציה CNS תוך הקלטה רציפה של RSNA ולחץ עורקים ממוצע. אם מיקרו-מזרק/פולס משמש למניפולציות בגזע המוח, ניתן להכניס אות לוגי ממכשיר זה להקלטות RSNA/BP כדי לתעד את העיתוי של מניפולציות CNS.
5. כאשר הניסוי הושלם, קבע את רמת הרעש על ידי ריסוק העצב הפרוקסימלי לאלקטרודות ההקלטה בין ג'ל הסיליקה לשריר עמוד השדרה. רשום לפחות 30 שניות של ערך "אפס" זה עבור RSNA. כגישה חלופית לכימות רעש, יש לתת חוסם גנגליונים קצר טווח כגון אטרופין, הקסמטוניום, כלוראיזונדמין או טרטרט פנטוליניום.
6. בזהירות להסיר את אלקטרודת RSNA ולהסיר עקבות של ג'ל סיליקה אלקטרודות חוט. שמור את האלקטרודה לשימוש חוזר. כבה את משדר הטלמטריה והסר אותו, תוך הקפדה שלא לפגוע בקצה הצנתר.

תוצאות

איור 1: RSNA ו-BP בתגובה להזרקת פנילפרין IV.ה-RSNA הגולמי (A) תוקן בגל מלא (B); RSNA כתוש מתוקן "אפס" מוצג בכניסה C. חושבו ממוצעים לא חופפים של 10 שניות (פחות רעש) (D). כדי לעורר את baroreflex, 0.1 מ"ל של phenylephrine (1 מיקרוגרם / מ"ל) הוזרק תוך ורידי (בחץ). עירוי הבולוס גרם לעלייה פתאומית ב-BP ולעיכוב חולף של RSNA. הטגמנטום הפדונק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חוט נירוסטה	מערכות A-M; סקווים, וושינגטון	791000	אלקטרודת RSNA
צינורות פוליאתילן (PE-50)	VWR; Radnor , פנסילווניה	63019-048	אלקטרודת RSNA; קנולציית כלי דם
מחבר פינים מיניאטורי	מערכות A-M; סקווים, וושינגטון	520200	אלקטרודת RSNA
הכלי לחיצה	חברת הייצור דניאלס; אורלנדו, פלורידה	M22520	אלקטרודת RSNA
רצועת מחבר	אמפנול; Clinton Township , מישיגן	221-2653	אלקטרודת RSNA
J-B קוויק אפוקסי	J-B Weld , סולפור ספרינגס, טקסס	8270	אלקטרודת RSNA
סיליקון	פרמטקס; הרטפורד, קונטיקט	2222	אלקטרודת RSNA
הפרין נתרן; הזרקה (10 מ"ל בקבוקון, 1000 U / מ"ל)	אספקת KV וטרינרית; דייוויד סיטי, נברסקה	P03466	פטנט קו ורידי
פנילפרין הידרוכלוריד; הזרקה (1 מ"ל בקבוקון; 10 מ"ג / מ"ל)	אספקת ניתוח ACE; ברוקטון, מסצ'וסטס	950-6312	בדיקת סימפתיאואינהיביציה כלייתית
שהייה כירורגית אלסטית עם וו יחיד	מנגנון הרווארד; Holliston , מסצ'וסטס	72-2595	החתך
סרט כירורגי משי	3M , מיניאפוליס, מינסוטה	1538-0	שהייה כירורגית מאובטחת
מחטים, 20 גרם	סיגמא-אולדריץ'; סנט לואיס, מיזורי	Z192554-100EA	קנולציית כלי שיט
Dumont #7 מלקחיים מעוקלים	כלים מדעיים משובחים; פוסטר סיטי, קליפורניה	11274-20	קנולציית כלי שיט
5-0 קשרי תפר משי	בריינטרי סיינטיפיק; בריינטרי, מסצ'וסטס	SUT-S 106	קנולציית כלי שיט
מלקחיים המוסטטיים עדינים	רובוז כלי ניתוח ושות'; גייטרסבורג, מרילנד	RS-7117	קנולציית כלי דם וניתוח RSNA
מלקחיים המוסטטיים קריים	כלים מדעיים משובחים; פוסטר סיטי, קליפורניה	13004-14	כיפוף מחטים
משדר טלמטריה	מדעי הנתונים הבינלאומיים; מיניאפוליס, מינסוטה	PA-10	ניטור לחץ עורקים ממוצע (טלמטריה)
מזרק רה-ג'ל	מדעי הנתונים הבינלאומיים; מיניאפוליס, מינסוטה	276-0038-001	שימוש חוזר במשדר (טלמטריה)
מתמר לחץ חד פעמי	טראנספק; סן קלמנטה, קליפורניה	MI-1224	ניטור לחץ עורקים ממוצע
מחדד לחץ שרוול שקוף	MILA אינטרנשיונל בע"מ; פלורנס, קנטקי	2281339	ניטור לחץ עורקים ממוצע
מלקחיים לשימורי כלי שיט	כלים מדעיים משובחים; פוסטר סיטי, קליפורניה	00574-11	החדרת קטטר
תפר שחור מונופילמנט ניילון 4-0 על מחט חיתוך לאחור	McKesson רפואי-כירורגי; סן פרנסיסקו, קליפורניה	S661GX	משדר טלמטריה מאובטח
מקלט מדידת שימוש	מדעי הנתונים הבינלאומיים; מיניאפוליס, מינסוטה	RPC-1	ניטור לחץ עורקים ממוצע (טלמטריה)
LabChart Pro (תוכנה), PowerLab (חומרת רכישה)	מכשירי AD; קולורדו ספרינגס, קולורדו	ML846, מטריצה MX2 2.0 (תואמת לטלמטריה הבינלאומית של Data Science)	3 אפשרויות לחומרת תוכנה/רכישה
SciWorks (תוכנה), DataWave (חומרת רכישה)	DataWave טכנולוגיות, לובלנד, קולורדו	לא ישים
ספייק 2 (תוכנה), מיקרו1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd. , לונדון UK	1401-3
מיקרו-מקדחה	רובוז כלי ניתוח ושות'; גייטרסבורג, מרילנד	RS-6300	ניתוח CNS
מסגרת ניתוח סטריאוטקסית	סטולטינג; ווד דייל, אילינוי	51600	ניתוח CNS
מגבר מיקרואלקטרודות עם קדם-מגבר 10X	מערכות A-M; סקווים, וושינגטון	1800-2	הקלטת RSNA
Retractors	כלים מדעיים משובחים; פוסטר סיטי, קליפורניה	17009-07	הקלטת RSNA
פינצטה במיקרו-ניתוח	כלים מדעיים משובחים; פוסטר סיטי, קליפורניה	11251-10	הקלטת RSNA
מיקרו-וו	כלים מדעיים משובחים; פוסטר סיטי, קליפורניה	10064-14	הקלטת RSNA
שמן מינרלי	פישר סיינטיפיק; וולת'הם, מסצ'וסטס	8042-47-5	הקלטת RSNA
צג שמע	מערכות A-M; סקווים, וושינגטון	3300	הקלטת RSNA
ג'ל סיליקה	ווקר, מינכן; גרמניה	RT601A-B	הקלטת RSNA
אטבים חשמליים	טייקו אלקטרוניקה; Schaffhausen, שוויץ	EB0283-000	הארקה או אבטחה של מחט זילוח
מספריים בון, נקודות ישרות/חדות	רובוז כלי ניתוח ושות'; גייטרסבורג, מרילנד	RS-5840	זילוח
מחט גאבאג'	מנגנון הרווארד; Holliston , מסצ'וסטס	75-0286	זילוח
משאבת זילוח Masterflex	קול-פרמר; ורנון הילס, אילינוי	7524-10	זילוח
צינורות סיליקון מאסטרפלקס עם ריפוי פלטינה	קול-פרמר; ורנון הילס, אילינוי	96410-15	זילוח
פורמלין (10% תמיסה חוצצת; 4 ליטר)	סיגמא-אולדריץ'; סנט לואיס, מיזורי	HT501128	זילוח
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'; סנט לואיס, מיזורי	S0389	הגנה מפני קריופרוטקציה