$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. הקלטות מהדק טלאים של תאים שלמים
- מעבירים את קטע הרקמה הראשון לתא ההקלטה השקוע בזרימה רציפה של תמיסת קרבס. הרכיבו את הקטע באמצעות משקולות קלות והטביעו את המטרה.
- זהו את האזור הסטריאטלי במיקרוסקופ וחפשו נוירונים חיוביים (מתוכנתים מחדש). בחר נוירון שהוא נרחב במורפולוגיה ואינו מכוסה על ידי צרורות סיבים או כלי דם.
- הכינו פיפטות זכוכית בורוסיליקט (3-7 MΩ) לתיקון ומלאו בתמיסה התוך-תאית הבאה (ב-mM): 122.5 אשלגן גלוקונאט, 12.5 KCl, 0.2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0.3 Na3GTP ו-8 NaCl, מותאם ל-pH 7.3 עם KOH.
- חברו את פיפטת הזכוכית לאלקטרודת ההקלטה וטבלו אותה בתמיסה. בדוק שוב את התנגדות האלקטרודה. לאחר מכן, התקרב לאט לתא עם פיפטה, תוך שמירה על לחץ חיובי קל על האלקטרודה כדי למנוע חיבור הקצה.
זהירות: היזהר לעקוב אחר התא שלך בזמן הירידה באלקטרודה ולא להלבין את הפלואורסצנטיות בתא (כלומר, לכבות את מנורת הפלואורסצנטיות כאשר אינך זקוק לה).
- שטפו את הרקמה שמסביב בזהירות תוך שימוש בלחץ חיובי של האלקטרודה והתקרבו לתא עם האלקטרודה. אתר את האלקטרודה ממש על גבי התא וירד עד שהאלקטרודה נגעה בקרום. צור אטם ג'יגה-Ω בין האלקטרודה לקרום התא, ועם פעימות לחץ שליליות, קרע את הממברנה כדי ליצור טלאי של תא שלם.
זהירות: תאי עצב מתוכנתים מחדש הם רגישים. היזהר בעת תיקון ולא להפעיל לחץ שלילי רב מדי כאשר מגיעים לחותם Giga-Ω או פתיחת קרום התא. כמו כן, טלאי על בעלי חיים מבוגרים דורש תרגול וסבלנות מכיוון שרקמת החיבור שלהם עבה יותר, וקשה יותר לדמיין את הנוירונים.
- בדוק את פוטנציאלי קרום המנוחה מיד לאחר הפריצה במצב מהדק זרם ורשום אותם לניתוח.
- במהדק הנוכחי, שמור על התא בין -60 mV ל -80 mV והזריק זרמים של 500 ms מ -20 pA ל +90 pA, עם מרווחים של 10 pA כדי לגרום לפוטנציאלי פעולה.