התקנת חלונות אופטיים במוחם של עכברים טרנסגניים כדי לדמות פעילויות עצביות

תקציר

מקור: Lin, X., et al. Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex using thy1-GCaMP6s Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את רישום הפעילות העצבית של המוח דרך חלון אופטי בעכברים טרנסגניים. העכברים מבטאים חלבון פלואורסצנטי המאפשר זיהוי פעילויות עצביות. חלק קטן מהגולגולת מוסר בזהירות כדי להתקין חלון אופטי, ולאחר מכן הגולגולת מכוסה במלט שחור כדי לחסום אור לפני ההדמיה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת בעל החיים לדימות

1. הניחו באזור הניתוח גזה סטרילית, צמר גפן וכלי ניתוח אוטוקלאביים. הפעל מעקר חרוזים מיקרו לעיקור בין ניתוחים של כלי ניתוח.
2. מרדימים את העכבר (זכר או נקבה, 1.5-2.5 חודשים, 20-25 גרם) על ידי הזרקה תוך צפקית (i.p.) של תערובת קטמין (17.2 מ"ג/מ"ל), קסילזין (0.475 מ"ג/מ"ל) ואצפרומזין (0.238 מ"ג/מ"ל) (6 מיקרוליטר/גרם משקל גוף). המתן עד לעומק ההרדמה הנכון כאשר בעל החיים מפסיק להגיב לגירוי צביטת בוהן ואין לו רפלקס הקרנית. במהלך הניתוח יש לתת מנת דחף של 1/3 מהמינון המקורי של קוקטייל ההרדמה לפי הצורך כדי לשמור על מצב ההרדמה המקורי.
3. יש להזריק בופרנורפין תת עורית (0.05-0.10 מ"ג/ק"ג) כחומר משכך כאבים לפני ניתוח. החל משחת מגן על העיניים של החיה כדי למנוע ייבוש הקרנית היווצרות קטרקט.
4. הניחו עכבר מהונדס GCaMP6s על כרית חימום למניעת היפותרמיה וכסו אותו ברפש כירורגי סטרילי. ייצבו את ראש החיה באמצעות מתאם להחזקת ראש לעכברים.
5. יש לגלח את הראש מעל רוב הקרקפת בעזרת סכין גילוח דו-צדדית. נקו את אזור הניתוח עם פד סטרילי להכנת אלכוהול, ואחריו תמיסת פובידון-יוד.

2. הכנת חלון גולגולת כרונית

1. בצע חיתוך מלבני של הקרקפת (2 מ"מ x 3 מ"מ) עם זוג מספריים בצד אחד (ימין) של הגולגולת. דחפו את העור הצידה בעזרת צמר גפן כדי ליצור אזור חשיפה בקוטר של >3 מ"מ (איור 1A). הסר את רקמת החיבור המחוברת לגולגולת על ידי גירוד עדין של הגולגולת עם להב מיקרוכירורגי קהה (להב אזמל #10; איור 1C).
2. סמנו את אזור S1 על-ידי ציור עדין של עיגול (3 מ"מ קוטר, קואורדינציה מרכזית: -1.5 מ"מ מהברגמה ו-2.5 מ"מ מקו האמצע) על הגולגולת באמצעות מקדחה דנטלית (איור 2B).
3. בצעו את אותו הליך בגולגולת השמאלית (איור 2B).
4. יש למרוח שכבה דקה של דבק סופר ציאנואקרילט על העצם כדי לספק בסיס למריחת צמנט דנטלי.
5. תחת מיקרוסקופ מנתח, דללו חריץ עגול בגולגולת סביב אזור S1 באמצעות מיקרו-מקדחה במהירות גבוהה (איור 1D). המטרה היא ליצור קצה חלק למיקום חלון אופטי עליו.
6. יש למרוח שוב ושוב נוזל מוחי מלאכותי (ACSF, טמפרטורת החדר) על הגולגולת מעת לעת במהלך תהליך הדילול כדי להקל על הקידוח ולפזר חום. בצעו את הקידוח לסירוגין כדי למנוע התחממות יתר כתוצאה מחיכוך. לשאוב את פסולת העצם עם קו ואקום ביתי או משאבת ואקום.
7. לאחר כ-2/3 עומק העצם, מדללים לאט ובזהירות את 1/3 העצם הנותרת עד שחתיכה עגולה של הגולגולת (דש העצם) נקייה לחלוטין מהגולגולת שמסביב.
8. הסירו לאט ובזהירות את דש העצם העגול בעזרת זוג מלקחיים # 5/45 וחשפו את הדורה (איור 2C; איור 1E).
9. שמרו על אזור המוח החשוף לח בעזרת ACSF (איור 1E). הימנע מכל נזק לכלי הדם הפיאלי מכיוון שדימום ישנה את זרימת הדם במוח, יאיץ את הנפיחות במוח ויפגע קשות באיכות ההדמיה.
10. בצע את אותו הליך בצד שמאל (contralateral) של הגולגולת.
11. להרכבת החלון האופטי יש להשתמש בדבק אופטי להדבקה וריפוי בין שכבות הזכוכית אחת בכל פעם. במידת הצורך, חממו את החלון האופטי (50°C למשך 12 שעות) באינקובטור כדי לשפר את הדבקה. החלון האופטי מכיל 2 חלקים: החלק העליון מכיל זכוכית כיסוי עגולה אחת בקוטר של 5 מ"מ והחלק התחתון מכיל 1–3 כוסות כיסוי עגולות בקוטר של 3 מ"מ (איור 2D).
12. אחסנו את החלון האופטי באתנול (70%, vol/vol) ושטפו אותו במי מלח סטריליים לפני השימוש. לפני התקנת חלון אופטי, בדוק אם יש פגמים בחלון האופטי, כולל כמות שגויה של דבק אופטי או יישור לא מדויק תחת סטריאוסקופ.
13. התקינו את החלון האופטי מעל אזור הקרניוטומיה (איור 2D). החלק העליון של החלון האופטי נשען על הגולגולת, והחלק התחתון של החלון האופטי נכנס לפתח הקרניוטומי ונשען על הדורה בנוכחות CSF (איור 2D, E).
14. אטמו את החלק העליון של קצה החלון האופטי לגולגולת בעזרת דבק העל Cyanoacrylate Super Glue (איור 2F; איור 1F).
15. כאשר דבק העל Cyanoacrylate התייבש, יש למרוח מלט דנטלי שחור (Dentsply) כדי לכסות את קצה הזכוכית. מרחו מלט דנטלי על כל שולי הגולגולת והפצע החשופים כדי לחסום אור (איור 2G-H; איור 1B).
16. בצע את אותו הליך בצד שמאל.
17. לאפשר לבעל החיים להתאושש על כרית החימום ולהחזיר את בעל החיים לכלוב הביתי שלו להתאוששות תחת ניטור מתאים. לספק מזון רטוב כדי להקל על לעיסה והידרציה. כדי להפחית את הכאב, יש לתת buprenorphine s.c. (0.05-2.0 מ"ג/ק"ג) כל 8-12 שעות לאחר הפציעה במשך יומיים. אפשר לעכבר להתאושש למשך 7-10 ימים נוספים לפני ההדמיה.

תוצאות

איור 1. יצירת חלונות דו צדדיים על הגולגולת. (A) תמונה מצולמת מראה 2 חלונות אופטיים גולגולתיים בכל צד של הגולגולת מעל אזור S1. (B) הגדלה גבוהה של האזור הארוז בתמונה (A) המראה חלונות אופטיים דו-צדדיים החושפים את הדורה הבסיסית וכלי הדם. סרגל קנה מידה = 680 מיקרומטר. (C) הגולגולת החשופה. (D) יצירת חריץ מעגלי שבתוכו רואים דש עצם מרכזי. סרגל קנה מידה = 900 מיקרומטר. (E) לאחר הסרת דש העצם, פתח הגולגולת התמל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C57BL/6J-Tg (Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	ג'קסון	24275	יכול להיות כל זן שנוצר על ידי אינדיקטור עצבי מקודד גנטית ואפקט המבטא את מחוון הסידן הפלואורסצנטי הירוק, GCaMP, בתת-קבוצות של נוירונים מעוררים בקליפת המוח.
ב6. CG-TG(THY1-EGFP)OJrs/GfngJ.	ג'קסון	7919	יכול להיות כל זן המבטא EGFP בתת-קבוצות של תאי עצב בתוך אוכלוסיות מסוימות בקליפת המוח; ומספק כתם בהיר וחיוני דמוי גולג'י.
Dumont מס' 5 מלקחיים, סטנדרטי, Dumoxel	כלים מדעיים משובחים	11251-30	יכול להיות כל מותג של בחירה.
Dumont מס' 5SF מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11252-00	יכול להיות כל מותג של בחירה.
מעקר חרוזים מיקרו	סאות'רן לבוור	B1201	יכול להיות כל מותג של בחירה.
מתאם אחיזת ראש SG-4N מבית Harishige	טריטק ריסרץ'	SG-4N	יכול להיות כל מותג של בחירה.
ערכה מושלמת אידיאלית למיקרו-מקדחה	מכשיר הרווארד	72-6065	יכול להיות כל מותג של בחירה.
קוצים למקדחה זעירה	כלים מדעיים משובחים	19007-05	יכול להיות כל מותג של בחירה.
זכוכית כיסוי עגולה, 3 מ"מ	הרווארד ביוסיינסז	W4 64-0720	יכול להיות כל מותג של בחירה.
זכוכית כיסוי עגולה, 5 מ"מ	הרווארד ביוסיינסז	W4 64-0700	יכול להיות כל מותג של בחירה.
דבק אופטי נורלנד	מוצרי נורלנד	7106	יכול להיות כל מותג של בחירה.
דבק על נוזלי Loctite	WB מייסון	LOC1647358	יכול להיות כל מותג של בחירה.
ערכת מלט אחיזה, אבקה וממס	דנטספלי	675570	יכול להיות כל מותג של בחירה. ערבבו 5 חלקים של אבקת מלט דנטלי לבנה (Grip Cement) עם חלק אחד של צבע אבקת טמפרה שחור (כדי להגן מפני אור; חלק מהמשתמשים מעדיפים יחס של 10:1).
קצף ג'ל	מור מדיקל	2928	יכול להיות כל מותג של בחירה.
מיקרו מנתח מספריים	רובוז	RS-5841	יכול להיות כל מותג של בחירה.
נוזל מוחי מלאכותי (ASF)	-	-	ACSF מכיל 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 ו 20 mM גלוקוז. בעבעו את ה-ACSF בחמצן (95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני) והתאימו את ה-pH ל-7.4. הכינו תמיסת ACSF טרייה לפני כל ניסוי.