ביצוע גירוי עצבי מערות בחולדות למדידת לחץ תוך מערות

תקציר

מקור: Hox, M., et al. גירוי עצבי מערות ורישום לחץ תוך מערות בחולדה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את הבידוד והגירוי של עצב המערה בחולדה מורדמת כדי לחקור שינויים בלחץ הדם בגוף המערה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת צינורות, אלקטרודות ומכשירים להליך הכירורגי

1. השתמש במכשירים המיקרוכירורגיים הבאים: מספריים כירורגיים, מספריים מיקרו זוויתיים, מלקחיים רקמות, זוג מלקחיים מיקרו מעוקלים של Dumont #7 ו- #5, מחזיק מחט מיקרו ו- retractors.
   הערה: זהו הליך אקוטי, ולכן אין צורך לעקר את המכשירים. לאחר השימוש, נקו ונגבו את הקצוות עם אתנול 70%.
2. השרו את הצינורית באתנול 70% ולאחר מכן שטפו אותה עם 0.9% NaCl סטרילי עם 100 U/mL הפרין לפני השימוש. השאירו את הצינור מלא כדי למנוע החדרת בועות אוויר למערכת.
3. חתכו צינור פוליאתילן (PE)-50 בקוטר 20-30 ס"מ כדי ליצור קטטר למדידת לחץ תוך-מערות (ICP). ודא כי הצינור קצר ככל האפשר כדי להפחית את הפחתת הלחץ.
4. כופפו מחט 24G סטרילית מצד לצד עד שהמחט נשברת באמצע. חבר את החתיכה עם השיפוע לקצה הדיסטלי של צינור PE להחדרה לתוך קרום הפין. הכנס את החצי השני לרכזת לחיבור למתמר הלחץ. מלאו את המערכת במי מלח הפרינים (100 U/mL).
5. כדי ליצור את האלקטרודה הדו-קוטבית המצופה טפלון, חתכו שני חוטי כסף בגודל 125 מיקרומטר לאורך שווה. השתמש בפיסת סרט כדי לחבר את החוטים לקצה השולחן ולהשחיל אותם יחד. לאחר מכן, חבר את האלקטרודה לצלחת שחורה.
6. בצע חתך קטן לתוך הטפלון והשתמש #5 מיקרו מלקחיים כדי להסיר אורך 4-5 מ"מ של ציפוי טפלון מקצות האלקטרודות. חתכו את הקצוות בעזרת אזמל כדי להשיג אורך אחיד וצרו ווים על ידי כיפוף הקצוות סביב הקצה הקהה של להב אזמל.
7. הדביקו את האלקטרודה כשהקצה נמתח מעט מעל קצה הלוח השחור כאשר הווים מכוונים כלפי מעלה. מערבבים את דבק הסיליקון על צלחת פלסטיק במשך 10 שניות ועוטפים בועת דבק סביב האלקטרודה 1-2 מ"מ מהוו.
8. הניחו לו להתייבש במשך כ-5 דקות לפני השימוש (איור 1). הפשיטו את הטפלון מקטע ארוך יותר בקצה השני כדי לאפשר חיבור למגרה.
   הערה: כאשר מבצעים מחדש את הווים בקצה הדיסטלי, ניתן לעשות שימוש חוזר באלקטרודה פעמים רבות.

2. הכנת החיה

1. לאחר הרדמת החיה, יש לגלח את החלק התחתון של הבטן, הצוואר והפרינאום. לשפשף את החיה עם 70% אלכוהול ואחריו פובידון-יוד שלוש פעמים. הניחו את החולדה על כרית כירורגית מחוממת במצב שכיבה. יש למרוח משחת עיניים וטרינרית ולהעביר את ההרדמה לקונוס אף עם 2.5% איזופלורן ו-0.8 ליטר/דקה חמצן כנשא.
   הערה: התאם את רמת האיזופלורן והחמצן כדי להשיג רמה מקובלת של הרדמה.

3. הכנה טרום ניתוחית

1. בצע את כל ההליך הכירורגי תחת מיקרוסקופ ניתוח: הגדלה הנעה בין 3.15X ל 20X מספיקה. יש להשתמש בכפפות ולשמור על סביבה נקייה לאורך כל הניתוח. הניחו את החולדה על דראפה.

4. דיסקציה של שריר Ischiocavernosus למדידת ICP

1. השתמשו באזמל, מספריים ישרים ומלקחיים זעירים מעוקלים של Dumont #7 כדי לבצע חתך עור אנכי בקוטר 1 ס"מ 5 מ"מ לרוחב לקו האמצע, המתחיל בגובה בסיס הפין ונמשך כלפי מטה (איור 2A). השתמשו ב-Q-tip והפרידו בזהירות את הפאשיה הצידית לשק האשכים (איור 2B). לאחר ניתוח הפאשיה, חברו את ה-retractors ומישוש בעזרת צמר גפן כדי למצוא את הטוברוזיות האיסכיאליות (איור 2C).
2. נתחו דרך רקמת השומן המדיאלית של הנקודה הזו עד להדגמה של שריר האיסכיוקברנוסוס (איור 3A). השתמש בזוג מלקחיים מיקרו מעוקלים של Dumont #7 והפריד לאורך את השריר. הטוניקה אלבוגיניאה תופיע כמבנה לבן בוהק (איור 3B). באמצעות מיקרו מלקחיים ומספריים זעירים, חשפו את הטוניקה אלבוגיניאה במידה מספקת כדי לראות את מסלולה (איור 3C).
3. לאחר כיול הגדרות המערכת, הכניסו צינורית דרך העור על הפרינאום, וודאו שהוא פועל במקביל לקרום הפין (איור 4). השאירו את הקו במקומו ושמרו על החתך לח עם מי מלח.

5. CN דיסקציה לגירוי

1. בצע חתך בטני תחתון של 2 ס"מ בקו האמצע דרך העור באמצעות אזמל תחילה ולאחר מכן זוג מספריים ישרים ומלקחיים זעירים. צור חתך תואם דרך הפאשיה לאורך linea alba ורקמת השרירים שמתחתיה כדי לחשוף את שלפוחית השתן והערמונית.
2. השתמש retractors כדי להשיג חשיפה טובה. השתמשו במקלוני צמר גפן כדי להפריד את הערמונית מרקמת השומן כדי לקבל הדמיה ברורה של גנגליון האגן העיקרי (MPG) והעצב המערתי (CN), הפועלים על האספקט הדורסולטרלי של הערמונית (איור 5).
3. לאחר הדמיה של MPG ו-CN, חתכו בזהירות את הפאשיה שמעל העצב 2-5 מ"מ דיסטלי ל-MPG בעזרת מספריים מיקרו זוויתיים (איור 6a). בעזרת שימוש במלקחיים מיקרו #5, פזרו את הרקמה בכל צד של העצב ומתחתיו כדי לשחרר חלק באורך 4 מ"מ (איור 6b), והחליקו תפר 9-0 מתחת לעצב (איור 6c).
4. הרימו מעט את העצב בעזרת התפר (איור 7a) כדי להקל על מיקום הווים של האלקטרודה הדו-קוטבית סביב העצב (איור 7b). תן לעוזר לערבב את דבק הסיליקון הדו-רכיבי עם קצה מחט אינסולין במשך 5 שניות. יבשו את העצב ומרחו את הדבק על האזור שסביב הווים והעצב (איור 7c, d). שמור על העצב מורם על ידי משיכה קלה על האלקטרודה במשך כדקה אחת כדי לאפשר לדבק להתייבש.
5. הסר את המסירים (retractors), למעט ה-retractors בצד ימין, כדי למנוע משיכה או סיבוב של האלקטרודה. מרטיבים את האיברים החשופים במי מלח ומניחים גזה ספוגה במי מלח על החתך.

6. קנולציית גוף מערות למדידת ICP

1. שחזור ויזואליזציה של albuginea טוניקה באמצעות retractors. הקפד לא לחבר את retractors לשריר ischiocavernosus כפי שהוא יהיה מעוות את crus.
2. חבר את המחט ושטוף את הצינור עם מלוחים heparinized לפני החדרתו לתוך albuginea tonica. שמור על טוניקה albuginea מתוח, באמצעות Dumont #7 מעוקל מיקרו מלקחיים ביד אחת (לא דומיננטי), מחזיק את טוניקה albuginea ואת שאר השריר דיסטלי מעל לנקודת ההחדרה. החזיקו את המחט עם מיקרו מלקחיים ישרים ביד השנייה הדומיננטית והכניסו אותה במקביל למהלך הגוף המערה (איור 8).
3. לדחוף את המחט 5-8 מ"מ לתוך גוף המערה. שטפו את הצינורית ולחצו על הקרוס כדי לבדוק את הקו (איור 9). ודא שאין נזילות. הדקו את הצינור לשולחן עם סרט דבק כדי למנוע משיכה בשוגג על הקו. הסר את המשיבים.

7. גירוי של CN

1. בעת הפעלת תוכנית ההקלטה (למשל, ספייק 2), הקלט ברציפות את הלחץ העורקי התוך-מערות והממוצע.
2. הגדר את הפרמטרים הבאים על ממריץ (לדוגמה, SD9 Grass Instruments, ראה טבלת חומרים) לגירוי CN: זרם ב- 1.5 mA, תדר ב- 16 הרץ, מתח ב- 3 V ורוחב פולס ב- 5 אלפיות השנייה. החל 50 שניות של גירוי עם מינימום של דקה אחת של מנוחה בין גירויים.
   הערה: הגירויים הראשונים בדרך כלל גורמים לתגובה מופחתת (איור 10).

תוצאות

איור 1. אלקטרודת כסף מצופה טפלון דו קוטבית. (A) בועת דבק באזור המעבר בין האלקטרודה המצופה לאלקטרודה הלא מצופה. (B) 2 ס"מ דיסטליים של האלקטרודה צמודים. (C) ווים מקבילים ללא ציפוי במרחק של 1 מ"מ זה מזה.

איור 2. דיסקציה של הגוף המערה - ציוני דרך. (A) חתך ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלקחיים אדסון	כלי מדעי משובח	11006-12
Dumont #7 מלקחיים	כלי מדעי משובח	11271-30
Dumont #5 מלקחיים	כלי מדעי משובח	11273-20
מספריים קשוחים של מאיו	כלי מדעי משובח	14110-15
מספריים קפיציים מיניאטוריים של Vannas	כלי מדעי משובח	15006-09
המוסטאט דק במיוחד	כלי מדעי משובח	13020-12
קריל המוסטאט	כלי מדעי משובח	13004-14
דבק קוויק-סיל	מכשירים מדויקים בעולם	קוויק-סיל
חוט כסף מצופה טפלון 0.125 מ"מ	מכשירים מדויקים בעולם	AGT0510
מחזירי חוטים אלסטיים	בהתאמה אישית
להב אזמל	כלי מדעי משובח	10023-00
צינורות PE-50	וורנר אינסטרומנטס	64-0753
23 גר' מחט	קרוס	121272
SD-9 מגרה דופק מרובע	סומטקו	1077/183
מתמר לחץ דם וכבל	מכשירים מדויקים בעולם	BLPR2
Raucotupf אפליקטורים עם קצוות כותנה	לוהמן-ראוכר	11966
מקלות עיניים פרו-אופטה	לוהמן-ראוכר	16515
NaCl 0,9% 100 מ"ל	בית מרקחת מקומי
הפארין	בית מרקחת מקומי
25 מ"ל מזרק	בית החולים האוניברסיטאי אודנסה
משחת עיניים וטרינרית - Viscotears	בית מרקחת מקומי
חוטי כסף	Science Products GmbH, היידלברג, גרמניה
דבק סיליקון	קוויק-סיל, מכשירים מדויקים בעולם, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב (ארצות הברית)