רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

תקציר

מקור: Zhu, M., et al. הכנת פרוסות חוט שדרה חריפות לרישום מהדק טלאי של תאים שלמים בנוירונים של ג'לטינוזה מהותית. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את ההליך לביצוע רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתאי עצב מסוג substantia gelatinosa (SG) של פרוסות חוט השדרה, תוך שימוש בטכניקות של מהדק טלאי של תאים שלמים כדי לנתח דפוסי ירי של נוירונים. שיטה זו מאפשרת לחקור תגובות עצביות לגירויים בנוירוני SG של חוט השדרה.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הסקירה האתית המתאימה של בעלי חיים.

1. הכנת פתרונות וחומרים

1. פתרונות
   1. הכנת נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) (ב-mM): 117 נתרן כלורי (NaCl), 3.6 אשלגן כלורי (KCl), 1.2 נתרן דימימן פוספט דיהידרט (NaH₂PO₄·2H₂O), 2.5 סידן כלוריד דיהידרט (CaCl₂·2H₂O), 1.2 מגנזיום כלוריד הקסהידראט (MgCl₂·6H₂O), 25 סודיום ביקרבונט (NaHCO₃), 11 D-גלוקוז, 0.4 חומצה אסקורבית, ו-2 נתרן פירובט. ראו טבלה 1.
   2. הכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת K⁺ (ב-mM): 130 K-גלוקונאט, 5 KCl, 10 Na_{2-פוספוקריאטין}, 0.5 אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA), 10 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאןסולפוני חומצה (HEPES), 4 מגנזיום אדנוזין טריפוספט (Mg-ATP) ו-0.3 ליתיום גואנוזין טריפוספט (Li-GTP). ראו טבלה 2.
   3. הכינו תמיסה תוך-תאית מבוססת צזיום (Cs⁺) (ב-mM): 92 צזיום מתאן סולפונט (CsMeSO₄), 43 צזיום כלוריד (CsCl), 10 Na_{2-פוספוקריאטין}, 5 טטראתילמוניום (TEA)-Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP ו-0.3 Li-GTP. ראה טבלה 3.
      הערה: יש להכין את כל התמיסות באמצעות מים מזוקקים. ACSF וסוכרוז-ACSF צריכים להיות קרבוגניים (95% O₂ ו-5% תערובת CO₂) לפני השימוש כדי לשמור על pH אופטימלי של כ-7.4, ויש להתאים את האוסמוליות של שתי תמיסות אלה ל-300-310 מיליוסמול (mOsm). מכיוון שחומצה אסקורבית עלולה להשפיע על תעלות סידן, יש להשמיט חומר זה אם רוצים לרשום זרמי סידן. יש למדוד ולהתאים את האוסמוליות וה- pH של תמיסות תוך תאיות ל- 290-300 mOsm ו- 7.2-7.3, בהתאמה. מומלץ לסנן את התמיסות התוך-תאיות עם מסנני 0.2 מיקרומטר ולאחסן את התמיסות כאליציטוטים של 1 מ"ל ב-20°C. Cs⁺ ו-TEA מיושמים בתמיסה תוך-תאית מבוססת Cs⁺ כדי לחסום את תעלת האשלגן, מה שתורם לשימוש במגבר כדי להחזיק את פוטנציאל הממברנה יציב ב-0 mV בעת הקלטת זרמים פוסט-סינפטיים מעכבים (IPSCs).
2. מכשירים
   1. עבור מערכת אלקטרופיזיולוגית טיפוסית, השתמש במיקרוסקופ זקוף המצויד בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית אינפרא אדומה (IR-DIC) ויעד טבילה במים ברזולוציה גבוהה, מצלמת CCD/CMOS, מגבר מהדק טלאי, מחזיק מיקרופיפטה ומיקרומניפולטור המאפשר התאמה עדינה של מיקום הפיפטה. יש צורך גם בשלב XY כדי להזיז את המיקרוסקופ.
   2. הרכיבו את כל הציוד על שולחן בידוד רטט מוקף בכלוב פאראדיי. חבר צג וידאו למצלמת הווידאו כדי להתבונן בתאי העצב ולדמיין את המיקרופיפטים.
3. מיקרופיפטות
   1. צור אלקטרודות הקלטה מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרופיפטה. התנגדות פיפטה טיפוסית נע בין 3-6 MΩ כאשר מלאים בתמיסה תוך תאית.

2. הקלטות מהדק טלאי של תא שלם

1. כדי לבצע את רישומי הטלאים של כל התא מנוירונים מסוג substantia gelatinosa (SG), השתמש בתמיסה תוך-תאית מבוססת K⁺ עבור רוב מקרי ההקלטה תוך יישום תמיסה מבוססת Cs⁺ רק להקלטה של זרמים פוסט-סינפטיים מעכבים.
2. העבירו בעדינות פרוסת חוט שדרה לתא ההקלטה, ולאחר מכן שמרו עליה באמצעות חוט פלטינה בצורת U המחובר בחוטי ניילון בחוזקה ליציבות פרוסה אופטימלית. יש לנקב בהתמדה את הפרוסה עם ACSF מבעבע ב-RT דרך מערכת כבידה ולהגדיר את קצב הזילוח על 2-4 מ"ל/דקה כדי להשיג חמצון מספיק.
3. זהה את האזור של SG (פס שקוף) באמצעות עדשת מיקרוסקופ ברזולוציה נמוכה, בחר נוירון בריא באמצעות המטרה ברזולוציה גבוהה כתא המטרה, והתאם אותו למרכז מסך צג הווידאו.
4. מלא מיקרופיפטה בנפח מתאים של תמיסה תוך-תאית מבוססת K⁺ או Cs⁺ לפי הצורך, הכנס את המיקרופיפטה למחזיק האלקטרודות, וודא שהתמיסה התוך-תאית באה במגע עם חוט הכסף שבתוך המחזיק.
5. הביאו את המיקרופיפטה למיקוד, טבלו אותה לתוך ACSF באמצעות מיקרומניפולטור, ולאחר מכן הפעילו לחץ חיובי מתון (~ 1 psi כאשר נמדד באמצעות מנומטר) כדי להרחיק את המיקרופיפטה מכל לכלוך ולכלוך.
6. הזיזו את המיקרופיפטה לכיוון תא העצב הממוקד בהדרגה. שחררו את הלחץ החיובי ברגע שהפיפטה מתקרבת לתא העצב, וגומה קטנה מאוד נוצרת על הקרום העצבי ליצירת ג'יגאזל.
7. שנה את פוטנציאל ההחזקה ל -70 mV, שהוא קרוב לפוטנציאל קרום המנוחה הפיזיולוגי (RMP) של תא. לאחר מכן, להחיל יניקה חולפת ועדינה על micropipette כדי לקרוע את הממברנה וליצור תצורה טובה של התא כולו.
   הערה: לאחר העברת הפרוסה לתא ההקלטה, הקפידו על זילוח יציב למשך 5 דקות לפחות כדי לפנות את הלכלוך על משטח הפרוסה. ראוי לציין כי היכולת להבחין בין נוירונים בריאים ולא בריאים/מתים היא בעלת חשיבות עליונה לאיטום טוב ולרישום יציב. נוירון לא בריא/מת הוא בעל מראה נפוח או מכווץ, יחד עם גרעין גדול נראה לעין, בעוד נוירון בריא מאופיין בצורה תלת ממדית (תלת ממדית) עם קרום בהיר וחלק, והגרעין שלו בלתי נראה. כדי להשיג תצורה של תא שלם, חיוני לפצות על קיבוליות מהירה או איטית שלב אחר שלב בעת הצורך. בטמפרטורת החדר (RT), פוטנציאל צומת הנוזלים מחושב כ-15.1-15.2 מיליוולט (mV) ו-4.3-4.4 מיליוולט בתמיסות תוך-תאיות מבוססות K⁺ ו-Cs⁺, בהתאמה. במחקרים שלנו, הנתונים שנרשמו לא תוקנו עבור פוטנציאל צומת נוזלי.
8. הקלטות של תכונות הממברנה הפנימית
   1. תיעוד תכונות ירי: בדוק את דפוס הירי של כל נוירון במהדק הנוכחי עם סדרה של פולסי זרם דה-פולריזציה של 1 שניות (25-150 פיקואמפר (pA) עם תוספת של 25 pA) ב-RMP. מדוד את הסף, המשרעת וחצי הרוחב של פוטנציאל פעולה בודד במצב לא מקוון.

טבלה 1: מתכון ל-ACSF

רכיב	משקל מולקולרי	ריכוז (mM)	ז/ל
NaCl	58.5	117	6.84
KCl	74.5	3.6	0.27
NaH2PO4·2H2O	156	1.2	0.19
CaCl2·2H2O	147	2.5	0.37
MgCl2·6H2O	203	1.2	0.24
NaHCO3	84	25	2.1
D-גלוקוז	180	11	1.98
חומצה אסקורבית	198.11	0.4	0.08
נתרן פירובט	110	2	0.22

טבלה 2: מתכון לפתרון תוך-תאי מבוסס K⁺

רכיב	משקל מולקולרי	ריכוז (mM)	מ"ג/100 מ"ל
קיי-גלוקונאט	234.2	130	3044.6
KCl	74.5	5	37.28
Na2-פוספוקריאטין	453.38	10	453.38
EGTA	380.35	0.5	19.02
HEPES	238.31	10	238.3
MG-ATP	507.18	4	202.9
Li-GTP	523.18	0.3	15.7

טבלה 3: מתכון לפתרון תוך-תאי מבוסס Cs⁺

רכיב	משקל מולקולרי	ריכוז (mM)	מ"ג/100 מ"ל
CsMeSO4	228	92	2097.6
CsCl	168.36	43	723.95
Na2-פוספוקריאטין	453.38	10	453.38
TEA-Cl	165.71	5	82.86
EGTA	380.35	0.5	19.02
HEPES	238.31	10	238.3
MG-ATP	507.18	4	202.9
Li-GTP	523.18	0.3	15.7

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NaCl	סיגמא	S7653	משמש להכנת ACSF ו- PBS
KCl	סיגמא	60130	משמש להכנת ACSF, סוכרוז-ACSF ותמיסה תוך-תאית מבוססת K+
NaH2PO4·2H2O	סיגמא	71500	משמש להכנת ACSF, סוכרוז-ACSF ו- PBS
CaCl2·2H2O	סיגמא	C5080	משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF
MgCl2·6H2O	סיגמא	M2670	משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF
NaHCO3	סיגמא	S5761	משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF
D-גלוקוז	סיגמא	G7021	משמש להכנת ACSF
חומצה אסקורבית	סיגמא	P5280	משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF
נתרן פירובט	סיגמא	A7631	משמש להכנת ACSF וסוכרוז-ACSF
סוכרוז	סיגמא	S7903	משמש להכנת סוכרוז-ACSF
קיי-גלוקונאט	וואקו	169-11835	משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת K+
Na2-פוספוקריאטין	סיגמא	עמ' 1937	משמש להכנת פתרון תאיים
EGTA	סיגמא	E3889	משמש להכנת פתרון תאיים
HEPES	סיגמא	H4034	משמש להכנת פתרון תאיים
MG-ATP	סיגמא	A9187	משמש להכנת פתרון תאיים
Li-GTP	סיגמא	G5884	משמש להכנת פתרון תאיים
CsMeSO4	סיגמא	C1426	משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs+
CsCl	סיגמא	C3011	משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs+
TEA-Cl	סיגמא	T2265	משמש להכנת תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs+
Na2HPO4	ריאגנטים כימיים Hengxing		משמש להכנת PBS
נימי זכוכית בורוסיליקט	מכשירים מדויקים בעולם	TW150F-4	קוטר חיצוני (OD) בגודל 1.5 מ"מ, קוטר פנימי (ID) בגודל 1.12 מ"מ
מושך מיקרופיפטה	סאטר אינסטרומנט	P-97	משמש להכנת micropipettes
מצלמת CCD אינפרא אדום	דג'-MIT	IR-1000
מגבר מהדק טלאי	הקה	EPC-10
מיקרומניפולטור	סאטר אינסטרומנט	MP-285
שלב X-Y	ברלי	גיברלטר X-Y
מיקרוסקופ זקוף	אולימפוס	BX51WI
אוסמומטר	מתקדמים	פיסקה 210
מד PH	מטלר טולדו	פ20