רישום פעילות חשמלית מוחית בעכברים מתנהגים באמצעות גשושיות סיליקון ליניאריות מרובות שוקיים

תקציר

מקור: Sauer, J., et al. Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Beacting Mice. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר פרוטוקול להשתלת גשושית סיליקון ליניארית מרובת שוקיים במוח העכבר כדי למדוד פוטנציאלי שדה מקומיים. ההליך כולל אבטחת הגשושית ליחידה סטריאוטקסית, מיקומה המדויק מעל אזור המטרה במוח, החדרתה למוח ואבטחתה באמצעות מלט דנטלי. לאחר ההשתלה, הרכבה מוגנת עם מעטפת. לאחר ההתאוששות, המערך מאפשר רישום פוטנציאלי שדה מקומיים, ומספק תובנות לגבי הפעילות העצבית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנות

1. תכנן ובנה כלי החדרה מתאים הנושא באופן ארעי את בדיקת הסיליקון ואת מחבר האלקטרודה במהלך תהליך ההשתלה. ראה איור 1 לדוגמה כלי הכנסה שנבנה בהתאמה אישית.
2. שחרר בזהירות את בדיקת הסיליקון ואת מחבר האלקטרודה מאריזתו באמצעות מלקחיים קרמיים.
3. הרם את לוח המחבר ותקן אותו היטב באמצעות מהדק תנין המחובר למעמד.
4. באמצעות סטריאוסקופ, יישרו את הגשושית עם כלי ההכנסה בעזרת מלקחיים קרמיים. יש למרוח שכבה ~2 מ"מ של שעוות פרפין מומסת עם צריבה כדי להדביק את הבדיקה לכלי ההחדרה. יש להקפיד שלא לגעת בשוקי הבדיקה במהלך הליך זה.
5. תקן את מחבר האלקטרודה לפיר של כלי ההכנסה באמצעות סרט הדבקה רגיל. שים לב שבהתאם ליצרן, ייתכן שיהיה צורך להלחם חוטי הארקה ללוח מחבר האלקטרודה לפני ההשתלה. הסר את הבידוד משתי חתיכות קצרות של חוט נחושת מבודד לכה באמצעות הלחמת פח המיושמת במגהץ הלחמה (400 מעלות צלזיוס). הלחמת את חוטי הארקה לחריצים המתאימים בלוח מחבר האלקטרודה.
6. הסר את הבידוד של שתי חתיכות נוספות של חוט נחושת. עטפו כל חוט נחושת חשוף שלוש פעמים סביב בורג נירוסטה (קוטר 1 מ"מ, אורך 2 מ"מ). יש למרוח שטף המתאים להלחמת פלדה ולהלחמת את חוט הנחושת לתחתית מכסה הבורג. ודא שהחצי התחתון של חוט הבורג נשאר נקי מהלחמת פח.
7. השתמש במולטימטר סטנדרטי כדי לבדוק אם יש מגע חשמלי בין חוט לבורג.
8. יש לחטא את שוקי בדיקת הסיליקון ואת ברגי הקרקע על ידי טבילה באתנול 70% (10 שניות).
9. הכינו כיסוי מגן לשתל הבדיקה על ידי חיתוך ראש פיפטת פסטר פלסטיק לשניים.

2. ניתוח השתלה

1. לעקר כלי ניתוח (מספריים, מלקחיים עדינים, מלחציים כירורגיים) עם מעקר חרוזים חם. נגבו את כל המשטחים באתנול 70%.
2. יש להשרות הרדמה עם 3% איזופלורן בחמצן המועבר ב~1 ליטר/דקה.
   1. לתחזוקה, השתמש 1 - 1.5% isoflurane. שימו לב שריכוז האיזופלורן הנדרש להשגת סבילות כירורגית יכול להשתנות מבעל חיים לחיה.
   2. סובלנות כירורגית יציבה מושגת כאשר בעל החיים אינו מגיב לצביטת בהונות. עקוב אחר קצב הנשימה של העכבר והתאם את ריכוז האיזופלורן במידת הצורך.
   3. יש למרוח משחה על עיני בעל החיים כדי למנוע התייבשות.
3. הרכיבו את העכבר במסגרת סטריאוטקסית על ידי הכנסה עדינה של מוטות אוזניים לתעלת האוזן. לאחר שראש העכבר מיוצב על ידי מוטות האוזניים, הניחו פיסת פה מעל החוטם לאספקת איזופלורן רציפה. הניחו את העכבר על מגבת או כרית מעל כרית חימום והזריקו בופרנורפין תת עורית (0.05 - 0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף) כדי להבטיח שיכוך כאבים לאחר הניתוח.
4. יש לגלח את הראש במכונת גילוח סטנדרטית ולחטא את העור באתנול 70%. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך לתוך העור לאורך קו האמצע של הגולגולת ולפתוח את העור באמצעות מלחציים כירורגיים.
5. יישרו את ראש החיה בעזרת כלי יישור סטריאוטקסי ליישור ברגמה ולמבדה. צריך להיות פחות מ 50 מיקרומטר של גובה בקיזוז בין bregma ו lambda. יתר על כן, יישרו את הראש לאורך הציר הבינוני על ידי מדידת העומק מברגמה על פני הגולגולת במרחקים מוגדרים ימינה ושמאלה (למשל, 1 מ"מ משמאל ומימין לברגמה). התאם את הטיית הראש במידת הצורך.
6. נקו את הראש עם 3% מי חמצן ונגבו לייבוש במגבוני כותנה סטריליים.
7. לקבוע את המיקום של craniotomy ביחס bregma באמצעות אטלס סטריאוטקסי מתאים.
8. באמצעות ראש מקדח בקוטר 0.9 מ"מ, קדח שני חורי בורג בעצם מעל המוח הקטן כדי למקם ברגי קרקע וייחוס. בנוסף, רצוי 1-3 חורים לברגי עיגון לייצוב השתל. המיקום של ברגי עוגן יהיה תלוי במיקום של craniotomy. להשתלה בהיפוקמפוס, הניחו ברגי עוגן מעל קליפת המוח הקדמית הקודקודית והאיפסילטרלית. מכניסים את הברגים לעצם באמצעות מברג מתאים. היזהרו לא לחדור למוח.
9. בצע את הקרניוטומיה על ידי דילול איטי של הגולגולת עם המקדחה באזור מלבני סביב צד ההשתלה. לעתים קרובות להרטיב את העצם עם חיץ פוספט מעוקר (PB). את הגולגולת הדקה הנותרת ניתן לנקב בעדינות ולהסיר בעזרת מחט הזרקה עדינה (27G) וזוג פינצטה.
10. נקבו בזהירות את הדורה מאטר עם מחט הזרקה דקה (27G). יוצרים וו קטן על ידי כיפוף קצה המחט עם זוג פינצטות ומושכים את הדורה להסרה. יש למרוח PB כדי למנוע התייבשות משטח המוח.
11. הרכיבו את כלי החדרת האלקטרודה על מחזיק סטריאוטקסי, אפסו את הגשושית על ברגמה, והעבירו את הגשושית לקואורדינטות הסטריאוטקסיות מעל הקרניוטומיה. לחדור לאט את פני השטח של המוח. ודא שפירי הבדיקה אינם מתכופפים. הימנע השתלה דרך כלי הדם.
12. הנמיכו לאט את הגשושית עד ~200 מיקרומטר מעל העומק הרצוי. מכסים את הקרניוטומיה והשוקיים של בדיקת הסיליקון בוזלין מעוקר להגנה. יש למרוח צמנט דנטלי כדי לקבע את בסיס הגשושית על בורג העיגון בגולגולת.
13. מיד לאחר מריחת הצמנט, העבירו את הגשושית לאט לעומק המטרה. התקדמות ~200 מיקרומטר האחרונים לאחר יישום הצמנט מפחיתה את התנועה הרוחבית של הגשושית ומבטיחה נזק מינימלי לרקמות באזור המטרה. שים לב שזמן הריפוי של המלט המשמש יכול להשפיע על שלב זה של הפרוטוקול. עם מלט המרפא במהירות, השמיט שלב זה והשתל ישירות את הגשושית לעומק המטרה על מנת למנוע נזק לגשושית הסיליקון.
14. לאחר שהמלט נרפא, שחררו את הבדיקה מכלי ההחדרה על ידי המסת השעווה עם צריבה.
15. שחררו את לוח המחבר מהתקן ההחדרה ומקמו אותו במקום מתאים על הגולגולת באמצעות מהדק תנין המחובר לידית ההחדרה. במקרה של השתלת בדיקה לתוך ההיפוקמפוס, הניחו את לוח המחבר על עצם הקודקוד הנגדית. קבע את לוח המחבר לגולגולת באמצעות מלט דנטלי.
16. הלחמת את הארקה ואת חוטי הייחוס של לוח המחבר לחוטים המחוברים לשני הברגים מעל המוח הקטן.
17. חתכו את כיסוי המגן לגובה הנכון והניחו אותו מעל בדיקת הסיליקון. קבע את הכיסוי ללוח המחבר ולגולגולת באמצעות מלט דנטלי, תוך הימנעות מהעור סביב הגולגולת החשופה. תפירת העור סביב אתר ההשתלה בדרך כלל אינה נדרשת.

3. החלמה לאחר ניתוח

1. החל טיפול משכך כאבים מתאים במשך יומיים לפחות (למשל זריקות תת עוריות של buprenorphine כל 6 שעות במהלך היום ומי השתייה לילה בשילוב עם carprofen (4 - 5 מ"ג / ק"ג משקל גוף) תת עורית כל 24 שעות). בית יחיד מומלץ כדי למנוע נזק לשתל.
2. יש להמתין לפחות שבוע להתאוששות. התייעץ עם הנחיות מקומיות לרווחת בעלי חיים.

4. רכישת נתונים

1. הקלט LFPs מעכברים הנעים בחופשיות באמצעות מערכת קליטת נתונים מתאימה המחוברת דרך קומוטטור. כדי לרכוש LFPs, השתמש בתדר דגימה של 1 - 5 קילוהרץ. קצבי דגימה גבוהים יותר (20 - 30 קילוהרץ) נדרשים אם יש לרשום פריקות של יחידה אחת יחד עם ה- LFP.
2. אחסן קבצי הקלטה גולמיים של הערוצים הבודדים לניתוח לא מקוון.

תוצאות

איור 1: תמונה של כלי ההכנסה. גשושית הסיליקון מחוברת לסיכת חרק המודבקת לבסיס מהדק תנין. פיר המחזיק יכול להיות מוכנס מניפולטור מיקרו סטריאוטקסי להשתלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מהדק תנין עם מעמד	רייכלט אלקטרוניק	HALTER ZD-10D
גשושית סיליקון	קיימברידג' נוירוטק	סדרה P 32
סטריאוסקופ	אולימפוס	SZ51
חוט נחושת מבודד לכה	Bürklin Elektronik	89 פ 232
ברגי הארקה	ברגים ועוד GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
השטף	סטנול	114018
מלקחיים קרמיים	כלים מדעיים משובחים	11210-60
שעווה פרפיין	סיגמא-אולדריץ'	327204
קוטרייזר	כלים מדעיים משובחים	18010-00
הלחמה ברזל	קורץ ארסה	OIC1300
אתנול	קרל רות'	9065.1
פיפטות פסטר	קרל רות'	EA65.1
מעקר חום	כלים מדעיים משובחים	18000-45
מסגרת סטריאוטקסית	דוד קופף	דגם 1900
מחזיק אלקטרודה סטריאוטקסית	דוד קופף	דגם 1900
איזופלורן	Abbvie	B506
רכז חמצן	רספירוניקס	1020007
בופרנורפין	Indivior בריטניה מוגבלת
מכונת גילוח חשמלית	טונדאו	אקו-XS
כרית חימום	תרמולוקס	463265/-67
מלחציים כירורגיים	כלים מדעיים משובחים	18050-28
מי חמצן	סיגמא-אולדריץ'	H1009
מגבוני כותנה סטריליים	קרל רות'	EH12.1
מקדחה	פרוקסון	מיקרומוט 230/E
מחט הזרקה 21G	ב. בראון	4657527
חיץ פוספט/מלח חוצץ פוספט
אטלס סטריאוטקסי	Elsevier	9.78E+12
מספריים כירורגיים	כלים מדעיים משובחים	14094-11
מלקחיים כירורגיים	כלים מדעיים משובחים	11272-40
מחטי הזרקה 27G	ב. בראון	4657705
וזלין
מלט דנטלי	סאן מדיקל	סופרבונד T&M
קרפרופן	זואטיס	רימדיל 50 מ"ג/מ"ל
מגבר הקלטה	אינטן טכנולוגיות	C3323
לוח רכישה USB	אינטן טכנולוגיות	C3004
כבלי הקלטה	אינטן טכנולוגיות	C3216
קומוטטור חשמלי	עדשות דוריות	HRJ-OE_FC_12_HARW