תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

תקציר

מקור: Hellmer, C. B., et al. הקלטת תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב בתכשירי פרוסת רשתית עכבר מותאמים לחושך באמצעות טכניקות מהדק טלאי. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת פתרון ניסיוני

1. הכינו את תמיסת הניתוח יום אחד עד שבוע לפני הניסוי בפועל. השתמש בתמיסת חיץ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) לדיסקציה ברשתית בגלל יכולת האגירה החזקה שלה בטמפרטורות נמוכות יותר16. מערבבים את כל הכימיקלים הבאים (ב-mM): 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.0 MgCl₂, 10 HEPES, 28 גלוקוז. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם NaOH. שמור את הפתרון במקרר עד 1 שבוע.
2. פתרון ההקלטה הוא המדיום של איימס, שהוא נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה (aCSF) המיועד לתכשירי רשתית. ביום הניסוי, שקלו את האבקה של איימס (4.4 גרם לתמיסה של 500 מ"ל) בצינור. כמו כן, שוקלים NaHCO₃ (0.95 גרם לתמיסת 500 מ"ל) ומערבבים עם אבקת איימס.
3. הכינו את תמיסת הפיפט התוך-תאית לרישומי מהדק טלאי עד יום הניסוי. ערבבו את כל הכימיקלים באופן הבא (ב-mM): 111 K-gluconate, 1.0 CaCl₂, 10 HEPES, 1.1 אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), 10 NaCl, 1.0 MgCl₂, 5 ATP-Mg ו-1.0 GTP-Na. התאם את ה- pH ל- 7.2 עם KOH. סנן את תמיסת פיפטה עם מסנן מזרק קונבנציונאלי. הכינו ~ 500 μl aliquots ואחסנו אותם במקפיא או במקפיא עמוק.

2. הכנה ליום הניסוי

1. בלילה שלפני הניסוי, הניחו עכבר בכלוב (C57BL/6J או רקע דומה, בן 4-8 שבועות, זכר) בחלל חשוך להסתגלות חשוכה למשך הלילה.
2. הכנה לנתיחה:
   1. ממלאים את תמיסת החיתוך (100 - 200 מ"ל) במיכל זכוכית, מניחים אותה על קרח ומבעבעים בחמצן למשך 10 דקות לפחות.
   2. התחל חמצון של הקופסה הכהה לאחסון הכנת הרשתית.
   3. הכינו כיסויי פלסטיק עם מסילות שומן להכנת פרוסות רשתית והניחו כל אחד מהם בכלי פלסטיק בקוטר 35 מ"מ.
   4. חבר סכין גילוח חדש למסוק (חותך רקמות).
   5. חותכים קרום מסנן לשני חצאים. זה מיועד לחיתוך רשתית.
   6. יישרו את כלי הניתוח והעבירו פיפטות ליד המיקרוסקופ המנתח. אזור העבודה חייב להיות מאורגן היטב כך שניתן יהיה לגשת בקלות לכל כלי בחושך.
3. הכנה להקלטות מהדק טלאי:
   1. ממיסים את אבקת איימס ואת NaHCO₃ במים מזוקקים (איימס 4.4 גרם ו-NaHCO₃ 0.95 גרם/500 מ"ל ddH₂O). בעבעו את התווך של איימס עם חמצן מעורב (95% O₂ ו 5% CO₂) במשך 30 דקות לפחות תוך חימום לרמת טמפרטורה הקלטה (~ 35 ° C). כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם NaHCO₃ בעודו עדיין מבעבע.
   2. הפשירו את תמיסת הפיפט הפנימית במהלך הדיסקציה. לאחר הפשרתו, להוסיף 0.01% sulforhodamine B עבור צביעה תוך תאית.

3. הקלטות מהדק טלאי מהכנת פרוסת הרשתית

1. הכנת הקלטה:
   1. מקציפים את צינורות הזילוח עם המדיום של איימס. תנו לכל הבועות לעבור דרכן בעת מילוי הצינור.
   2. הכינו פיפטות הקלטה מהדק טלאי עם מושך. כדי למלא פיפטה בתמיסת פיפטה, טובלים בחלק האחורי של פיפטה למשך דקה אחת עד שקצה הפיפטטה ממולא בחזרה. לאחר מכן, למלא ~ 1/3 של פיפטה באמצעות מילוי מיקרו פיפטה. אחסנו כל פיפטה בקופסת פיפטה לחה.
   3. הפעל את הציוד להקלטות מהדק תיקון, כולל המחשב, המגבר, מצלמת התקן מצמיד הטעינה (CCD) והמיקרוסקופ.
2. כבה את האור בחדר. הניחו פרוסת רשתית על תא שלב המיקרוסקופ באמצעות צופה אינפרא אדום. לאחר שהוא משותק, להתחיל זילוח מתמשך. הגדר את טמפרטורת הזילוח על 33 עד 37 ° C.
3. הצג את משטח הפרוסה באמצעות מצלמת CCD. התמקד במיקום היעד שבו שוכנים סוגי תאי היעד. בחר תא בעל מראה בריא להקלטת מהדק טלאי (כלומר, עליו להיות בעל משטח חלק למראה וצורת תא טובה).
4. מניחים פיפטה הקלטה במחזיק פיפטה. מקדמים את הפיפטה להכנת הפרוסה. כאשר הוא קרוב להכנת הפרוסה (~ 2 מ"מ מעל), למצוא את קצה פיפטה עם המיקרוסקופ. ברגע שקצה הפיפטה נראה מתחת למיקרוסקופ, הזיזו את הקצה כלפי מטה לכיוון תא המטרה.
5. הגדר את המגבר. כוונן את פיפטה ב 0 mV / 0 pA (אפס) והתחל פולס חשמלי רציף של ~ 5 mV ב ~ 10 הרץ. בדוק את התנגדות פיפטה; ההתנגדות האידיאלית היא בין 5 ל-10 MΩ עבור רוב תאי העצב ברשתית.
6. התחילו לנשוף החוצה מהקצה. השתמש בפיה, או השתמש במזרק, כדי להפעיל לחץ חיובי כאשר פיפטה טובלת בתמיסת האמבטיה. נשפו ללא הרף את התמיסה הפנימית עד שהקצה נמצא על פני תא היעד.
   1. כאשר הלחץ החיובי יוצר גומה קטנה על פני התא, הקדמו מעט את הקצה והפסיקו לנשוף החוצה. בדוק את התנגדות פיפטה, אשר אמור להגדיל. אם הוא גדל ברציפות, להשאיר אותו לפקח על ההתנגדות עד שהוא מגיע >1 GΩ (gigaseal). אם ההתנגדות אינה עולה באופן ספונטני, להפעיל בעדינות לחץ שלילי עד שהוא הופך gigaseal.
7. לאחר השגת הג'יגאזל, שנה את פוטנציאל ההחזקה ל -70 mV. לאחר מכן, לסירוגין להפעיל לחץ שלילי כדי לקרוע את הממברנה בתוך קצה פיפטה. כאשר תצורת התא כולו נעשה, התנגדות פיפטה יכול להיות בין 500 MΩ ו 1 GΩ, ואת הזרם הקיבולי נראה. לפעמים ניתן להבחין בזרמים פוסט-סינפטיים ספונטניים.
8. הקלט את יחסי הזרם-מתח (I-V) מ- -80 עד +40 mV. סוגים שונים של תעלות מגודרות מתח מופעלים בהתאם לסוג התא.
9. הקלט זרמים סינפטיים או מתחים המעוררים אור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברים (בני 28-60 יום, זכר)	מעבדת ג'קסון	זן C57BL/6J
האבקה הבינונית של איימס	סיגמא	A1420	מצוין
מציג אינפרא אדום	אופטיקה של ינשוף לילה	NOBG1	החדר מציע נוף בהיר. מיקוד אובייקטים קטנים הוא בעיה.
טווחי כיס אינפרא אדום	ב.א. מאיירס	כיס OWL Gen 3 NV	נוף מעולה
פולר	סאטר	P-1000	מצוין. הכינו פיפטות בגודל עקבי.
קופסה כהה	שקנאי	קופסה כהה	מצוין
מערכת מהדק תיקון	סיינטיפיקה	היקף פרוסה 2000	התקנה מעולה. רוב רכיבי המפתח כלולים בחבילה אחת. מיקרומניפולטורים מצוינים.
מגבר	התקנים מולקולריים	multiclamp 700B	שליטה מעולה וקלה.
רכישת תוכנה	התקנים מולקולריים	תוכנת pClamp	שליטה מעולה וקלה.
מקור אור (LED)	LED מגניב	מערכת pE-2 4 ערוצים	מצוין
מצלמת CCD	הדמיית Q	רטיגה 2000	מצוין
כלוב פאראדיי	עבודת יד