הקלטה משולבת של תפוקת Afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי שיער עכבר

תקציר

מקור: Bewick, G. et al., הקלטה משולבת של פלט רגשי מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בקצות זקיק זקיק עכבר. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את ההקלטה המשולבת של פלט afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי השיער של פינת עכבר. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בגירוי מכני של קצות העצבים של זקיקי השערה לפני ואחרי חשיפה לצבע פלואורסצנטי של קרום השיער, רישום אלקטרופיזיולוגי של פוטנציאלי הפעולה שנוצרו, והדמיה של תיוג מסוף העצבים בזקיקי השיער.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הגדרת הקלטה אלקטרופיזיולוגית

1. הצמד את עור האוזן החיצונית של העכבר (פינה) לבסיס מרופד PDMS של תא הקלטה עם סיכות חרקים עדינות סביב הקצוות (~ 6-8 לכל אוזן), ומקם את העצבים הנקיים בבסיס האוזן ליד שתי אלקטרודות יניקה – אחת להקלטה (לקליטת העצב) והשנייה אלקטרודה אדישה (כדי לספק את האות הניטרלי למגבר דיפרנציאלי).
2. עבור אלקטרודת ההקלטה, התאימו בזהירות את הצמצם ואת הקוטר הפנימי של הפתח לעובי המשולב של שני העצבים, כך שיתאימו בצורה נוחה ככל האפשר ולאורך גדול ככל האפשר.
3. משכו את העצבים לתוך האלקטרודה על ידי יניקה עדינה ממזרק 2 מ"ל המחובר לקצה השני עם צינורות גומי סיליקון. ודא שהעצבים ישרים, לא מקופלים או כפולים.
4. לפתח התנגדות חשמלית גבוהה / התאמה עכבה על ידי שימוש יניקה חזקה יותר כדי למשוך רקמת חיבור או רקמת שומן כדי ליצור פקק שאוטם בחוזקה את הצמצם סביב העצב.
5. מלא את האלקטרודה השנייה (האדישה) במי מלח על ידי יניקה במידת הצורך (ניתן למלא אותה על ידי פעולה נימית).
6. הניחו חוטי הקלטה זהים (כסף או פלטינה) לתוך הבור הפנימי של אלקטרודות ההקלטה כדי ליצור מגע עם המלח והעצב (הקלטה) או הקצה הצר והמלוטש באש (אדיש) של האלקטרודה. כל אלקטרודה מולחמה בנפרד לליבות שונות של כבל דו-ליבות. הניחו את אלקטרודת האמבטיה (כדורית Ag/AgCl) לתוך האמבטיה וארקו אותה למסך של כבל שתי הליבות המחובר לאלקטרודות ההקלטה.
7. הזינו את הפעילות החשמלית משתי האלקטרודות לתעלות נפרדות של מגבר דיפרנציאלי, פילטר (פס 0.2-2 קילוהרץ) וצפו במסך אוסצילוסקופ. בדקו שרמות הרעש החשמלי בערוץ A (הקלטה) ובערוץ B (אדישות) נראות דומות. בשלב זה ייתכן שלא ניתן יהיה לראות את פוטנציאלי הפעולה הספונטניים הרגילים בערוץ A לפני ששתי האלקטרודות מאוזנות.
8. תקן את כל ההבדלים ברעשי רקע בין אלקטרודות על-ידי הגדלת העכבה של אלקטרודות הקלטה (ערוץ A) או אדישות (ערוץ B). עשה זאת על ידי מציצת רקמת החיבור העטרה (שומן) עמוק יותר לתוך האלקטרודה ו / או הפעלת כוח יניקה גדול יותר על מזרק 50 מ"ל.
   1. לאחר ש"מאוזנים" בדרך זו, חזרו להקלטה דיפרנציאלית (A-B) וחפשו פוטנציאלי פעולה ספונטניים (APs) בעקבות או בעת ליטוף שערות בשולי הפינה. אם לא נראית פעילות (קוצים), בדקו שוב את ההתאמה ההדוקה של העצב באלקטרודת הרישום ורקמת החיבור העטרה באלקטרודה האדישה – בדרך כלל, ככל שהאטם הדוק יותר (התנגדות גבוהה יותר) והעכבה בשתי האלקטרודות שווה יותר, כן ייטב. עם תרגול, זה ישיג איכות טובה (>2: 1) אות:יחס רעש.
9. הקלט את האלקטרונוירוגרמה באמצעות ממשק מעבדה ותוכנת אלקטרופיזיולוגיה הפועלת במחשב. פלט שמע של ספייקינג שימושי מאוד וניתן להשיג אותו על ידי הזנת הנוירוגרמה דרך מגבר שמע ורמקול שמע נלווה. כוונן את הסף כך שיהיה ממש מעל לרעש הבסיס (מזוהה על-ידי היעדר 'רחש' של רעש לבן).
10. כדי להגביר את הגישה של צבע סטיריל פלואורסצנטי לקצות הלנסולטים, קלפו בזהירות את שכבת השומן התת-עורית ליד שולי הפינה, פתחו חלון של ~5 מ"מ x 5 מ"מ, וחשפו את הדרמיס ואת בסיס הזקיקים (איור 1A, B).
11. הצמידו לאחור קפל של ~1 מ"מ של עור אוזניים נקי שומן בשוליים המובילים (ברמת החלון שזה עתה יוצר, אם רלוונטי), והותירו רווח ברור מלא במי מלח בין שכבות העור המפוספסות. לטפו בעדינות את השערות הבולטות לאורך הקצה המקופל בעזרת סיכה או מלקחיים עדינים מקורקעים, מבלי לגעת בעור, כדי לאתר את אזור פלט ה-AP המרבי באוסילוסקופ ואת ה'לחיצות' וה'קפיצות' הייחודיות בפלט השמע.

2. הקלטת פוטנציאלי פעולה מעוררי גירוי

1. מקמו את גשושית הגירוי המכנית – זכוכית מיקרואלקטרודה בורוסיליקט מלוטשת אש בקוטר 10 ס"מ המחוברת למפעיל פיאזו-חשמלי קרמי – כך שהתנועה תהיה מקבילה לקפל העור. מניחים את הקצה במרחק של כ-0.5-1 מ"מ מקפל העור, כך שהוא נוגע בשערות אך לא בעור. ודא גירוי יעיל על ידי הזזת קצה הגשושית באיטיות באופן ידני כדי להסיט את השערות ולהתבונן/להקשיב לדוקר.
2. השתמש בתוכנה כדי להניע גירוי מכני של 1-3 שערות (למשל 3 שניות בסינוסואידים של 5 הרץ, כל 10 שניות. עקירה של בדיקה 200-500 מיקרומטר), ולהקליט את התגובות מעוררות הגירוי בעצבים.
3. תן מספר רכבות גירוי מכני זהות במרווחים של 10 שניות. מטב את מיקום הגשושית לחזרתיות, ולאחר מכן הפחת את תדירות הגירוי בהתאם לפרוטוקול הניסוי (למשל קצב חזרה יורד מ-10 שניות ל-30 שניות).
4. השתמש בתוכנה כדי להבחין בפעילות דמוית נקודת גישה, לדוגמה, באמצעות סף פשוט המוגדר ל~פי 2 ממשרעת הרעש בתדר גבוה ו~25% מנקודות הגישה הגדולות ביותר.
5. ספרו את נקודות הגישה שחצו את הסף כ"אירועים", וכמתו את התדירות והמאפיינים של נקודות הגישה המיוצרות.

3. הקלטת ירי מעורר גירוי בשילוב עם N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) תיוג פירידיניום דיברומיד

1. כדי לבחון את ההשפעות של צבעי סטיריל על ירי אפרנטי מעורר גירוי ותיוג הדקים, הוסיפו לתמיסת הרחצה את הריכוז המתאים של צבע סטיריל לפי בחירתכם והמשיכו עם ההקלטה החשמלית.
2. לאחר זמן החשיפה הנדרש (בדרך כלל לפחות 30 דקות), הכינו את ההכנה לצפייה בזקיקים. פתחו את דש העור על ידי הסרת סיכות התומך, וחשפו את אזור העור הנקי כדי לחשוף את התיוג הטרמינלי.
3. שטפו את הצבע החיצוני במי מלח ללא צבע, ובצעו 3 שינויים מלאים של מלח.
4. יש לדגור על השינוי הסופי של מי מלח נטולי גזים למשך 10-15 דקות כדי לאפשר לזיהום הצבע המתמשך ביותר להיפלט מממברנות חשופות/חיצוניות.
5. יש להסיר את שאריות הצבע הלא מופנם על הממברנות בעזרת חומר מבודד (בטא-ציקלודקסטרין סולפובוטילציה, 1 מ"מ, 5 דקות) במי מלח.
6. מעבירים את תא ההקלטה לשלב של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף ומפעילים את התא עם מנגנון תנועת הבמה/החלקה.
7. האירו את התכשיר באור עירור המתאים לצבע הסטיריל. השתמשו במטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10X או 25X כדי לצפות בתווית הזקיק (איור 1).

תוצאות

איור 1: סידור הקלטה אלקטרופיזיולוגית ו-N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) Pyridinium dibromide תיוג של קצות זקיקי שיער Afferent Lanceolate. (A) תכשיר פינה שהוקם לניסוי אלקטרופיזיולוגי המראה את כיוון הפינה, מיקום העצבים, אלקטרודות הרישום והאזור החשוף של עצבוב זקיק לאחר הסרת רקמת שומן. (B) מספר זקיקי שיער נראים בתאורת שדה בהירה באזור שנוקה מרקמות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PDMS - סילגארד 184	דאו קורנינג		פולימר סיליקון מוצק גמיש, אינרטי ושקוף.
מספר 3 מלקחיים Dumont	כלים מדעיים משובחים	11231-20
סיכות חרק אוסטרליץ	כלים מדעיים משובחים	26002-10	סיכות עדינות מאוד לחיבור הכנת פינה בצורה מאובטחת ל- PDMS עם נזק מינימלי.
מגבר מקדים דיפרנציאל AC	דיגיטימר	נוירולוג NL104A	הגדלת הגודל של אלקטרונוירוגרמה afferent נכנס. הקלטה דיפרנציאלית ממזערת את הרעש החשמלי החיצוני ואת הסחף הבסיסי.
מסנן מעבר גבוה/נמוך	דיגיטימר	נוירולוג NL125	מיזוג אותות, על ידי הפחתת רעש חשמלי חיצוני כדי להבטיח את יחס האות לרעש הטוב ביותר.
ספייק טריגר	דיגיטימר	נוירולוג NL201	מגדיר את סף גלאי האירועים ומציג אותו באוסילוסקופ. זה מראה את יעילות הזיהוי הפוטנציאלית של הפעולה.
מגבר שמע ורמקולים	דיגיטימר	נוירולוג NL120S	ניטור שמע שימושי לנוכחות ירי חשמלי של קצות החישה תוך התאמת הכנת הגירוי המכני במורד המיקרוסקופ
אוסצילוסקופ	דיגיטימר	PM3380A	אנו משתמשים במודל ישן זה אך כל אוסצילוסקופ סטנדרטי יספיק.
פרוסת פייזו אלקטרו-קרמית	Morgan Electroceramics , סאות'המפטון UK	PZT507	אלקטרופיזיולוגיה/ממשק מחשב
ספק כוח אלקטרו-קרמי Piezo	תוצרת בית		פלט DC 0-200V להנעת תזוזת הפרוסות הקרמיות, עם בקרה אלקטרונית משתנה של הפלט באמצעות תוכנת הקלטה/גירוי וממשק מחשב. אנו משתמשים בתוכנת Spike2 ובממשק מחשב 1401micro.
תוכנת אלקטרופיזיולוגיה	קיימברידג' עיצוב אלקטרוני (CED)	ספייק2 v7	תוכנת הקלטה, גירוי וניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגית
ממשק מעבדה	קיימברידג' עיצוב אלקטרוני (CED)	1401 מיקרו	ממשק אלקטרופיזיולוגי, בין המגבר/פילטרים לבין המחשב. הוא מזין את האלקטרונוירוגרמה וגם מניע את התנועה האלקטרו-קרמית.
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	בדיקת קרום פלואורסצנטי המתפצלת באופן הפיך לעלון החיצוני של קרום התא. משמש בעיקר לניטור קרום השלפוחית אנדו-/אקסוציטוזה.
עו"ד 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	נגזרת b-ציקלודקסטרין סולפונית המדרגת FM1-43 (וצבעי סטיריל פירידיניום אחרים) מתוך הממברנות החשופות, ומשאירה את הצבע המופנם להיראות בצורה ברורה יותר על ידי הורדת תיוג הרקע/פלואורסצנטיות.
Retiga Exi מהיר 1394	Qimaging		מצלמת CCD מונוכרום מקוררת - דגם בסיסי
Volocity 3D תוכנת ניתוח תמונה	פרקין אלמר	וולוסיטי 6.3	תוכנה ללכידת וניתוח תמונות.