רישום חוץ-תאי של פעילות חשמלית במערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה

תקציר

מקור: Swale, D. R., et al. Electrophysiological Recording of the Central Nervous System Activity of Third-instar Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון מדגים רישום חוץ-תאי של פעילות עצבית ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי דרוזופילה. מערכת העצבים המרכזית הטרנסקטיבית ממוקמת בתא הקלטה, והפעילות החשמלית לעצב יורד נרשמת כדי לקבוע את תדר הירי הבסיסי. לאחר מכן מוצג סוכן בדיקה, והשינוי בתדירות הירי נרשם כדי לקבוע את ההשפעה המעוררת או המעכבת של הסוכן.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. לנתח ולהכין את הזחל Drosophila CNS

הערה: שיטות לדיסקציה CNS של הזחל מודגמות בבירור ב-Hafer וב-Schedl, אך שיטות אלה שפורסמו בעבר מפחיתות את אורך תאי העצב היורדים החשובים למדידת תדירות ספייק. כאן, שיטה נוספת מתוארת כדי להסיר את CNS הזחל השומר נוירונים יורדים ארוכים ושלמים.

1. הכנת מי מלח.
   1. הכינו את הדיסקציה וההקלטה של מי מלח לדברים הבאים ב-mM: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl₂, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES); titrate pH עד 7.25.
2. לנתח את הזחל Drosophila CNS.
   1. זהו וחלצו דרוזופילה מלנוגסטר נודד מבקבוקון התרבית והכניסו אותו ל-200 מיקרוליטר מלח (איור 1A).
   2. אחזו בווי הפה בעזרת זוג מלקחיים עדינים ואחזו בבטן הרימות בעזרת זוג מלקחיים שני (איור 1B).
      הערה: אין להפעיל לחץ רב מדי על הבטן מכיוון שהדבר עלול לגרום לקריעה של שכבת העור הדקה של הרימות.
   3. משכו בעדינות את ווי הפה והבטן לכיוונים שונים כדי להפריד את הקצה הקאודלי של הרימות מאזור הראש ולחשוף את הקרביים של הרימות (איור 1C).
      הערה: מערכת העצבים המרכזית תהיה שזורה בקנה הנשימה ובמערכת העיכול. אין לחתוך את מערכת העצבים המרכזית מכל רקמה כדי למנוע חיתוך העצבים ההיקפיים היורדים.
   4. הקניט את מערכת העצבים המרכזית ממערכת העיכול ומקנה הנשימה בעזרת מלקחיים (איור 1D).
   5. במידת הצורך, לשבש את מחסום הדם במוח על ידי העברה ידנית של מערכת העצבים המרכזית האחורית לאונות המוח עם מספריים קפיציים Vannas.
      הערה: זה צריך להיעשות על בסיס התכונות הפיזיוכימיות של הכימיקל בשימוש. הקו האדום באיור 2A הוא נקודת הטרנסקציה המוצעת ומערכת העצבים המרכזית שעברה טרנסקטציה עם גזעי עצבים היקפיים יורדים שלמים שמוצגים באיור 2B. מערכת העצבים המרכזית מוכנה לניסויים לאחר השלמת שלב 1.2.5.

2. הקלטה חוץ-תאית של דרוזופילה CNS.

1. הכן את מערכת העצבים המרכזית להקלטה.
   1. משוך אלקטרודת פיפטה זכוכית מנימי זכוכית בורוסיליקט להתנגדות של 5-15 mΩ.
   2. הכנס את CNS transected לתוך תא שעווה המכיל 200 μL של מלוחים. הדקו סיכת חרק לא מצופה עם תפס התנין המולחם לחוט הארקה והכניסו את הסיכה לתמיסת המלח כדי להשלים את המעגל.
   3. באמצעות micromanipulators, לכוון את האלקטרודה לקצה הקאודלי של CNS transected. בטל הקלטה של רעשי רקע על ידי התאמת רמת הסף בתוכנת הרכישה/ניתוח לפני מגע עם גזעי העצבים ההיקפיים.
   4. משוך כל עצבים היקפיים נוחים לתוך אלקטרודת היניקה על ידי הפעלת לחץ שלילי קל על המזרק.
      הערה: תדירות הירי הבסיסית מתואמת למספר תאי העצב הנמשכים לתוך האלקטרודה, כאשר יותר תאי עצב גורמים לעתים קרובות להתנגדות מוגברת של האלקטרודה.
2. התחל הקלטה חוץ-תאית של פעילות עצבית יורדת במערכת העצבים המרכזית.
   1. התחל את ההקלטה בתוכנת רכישת הנתונים ועקוב אחר תדירות הירי הבסיסית. אפשר לקצב הירי להתאזן למשך 5 דקות לפני איסוף נתוני קצב הירי הבסיסי.
   2. השליכו את ההכנה וההקלטה אם דפוס הירי של טיפול הבקרה אינו דפוס מתפרץ דומה לזה שמוצג באיור 3A.
      הערה: שינוי דפוס הירי מצביע על פעילות חריגה או לא יציבה של מחולל הדפוסים המרכזי, אשר יכול לשנות את התפקוד העצבי.
   3. לאחר 5 דקות, הוסף 200 μL של מלוחים + רכב כדי להביא את הנפח הכולל של התא ל 400 μL כדי להתחיל להקליט קצב ירי בקרה.
   4. לאחר התבססות קו הבסיס (3-5 דקות), משכו 200 μL של מלוחים והוסיפו 200 μL של חומר הניסוי המסיס במי מלח.
      הערה: דימתיל סולפוקסיד (DMSO) הוא הממס המומלץ לתרכובות ליפופיליות ולא יעלה על 0.1% v/v.
   5. יש ליישם ריכוזי תרופות באופן סדרתי (ריכוזים נמוכים עד גבוהים) ולתעד כל ריכוז לפרק זמן מוגדר (שנקבע על ידי החוקר בהתבסס על התכונות הכימיות של התרופה). תייג נקודת זמן זו של יישום התרופה בתוכנת הרכישה/ניתוח על ידי הכללת הערה הכוללת את התרופה ואת הריכוז הסופי.
      הערה: פעילות הירי של מערכת העצבים המרכזית תרד בכ-10-20% לאחר 30-50 דקות לאחר הדיסקציה ולכן יש לבצע בקרות מתאימות שאינן מטופלות, וטיפולים תרופתיים לא יחרגו מפרק זמן זה.

תוצאות

איור 1: שיטה לכריתת מערכת העצבים המרכזית מרימות בכוכב שלישי. (א)רימות שלמות שקועות ב 200 μL של מלוחים. החץ מציין את ווי הפה המשמשים להפרדת דופן הגוף. (B) שני זוגות מלקחיים מונחים במרכז הרימות ועל ווי הפה כדי להתחיל בהפרדת דופן הגוף. (C) דופן הגוף מופרדת על ידי הפעלת לחץ קל ומתמשך כדי לחשוף את הקרביים. (ד)CNS נראה בבירור (חצים לבנים) והוא שזור מדי פעם...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Drosophila melanogaster (זן OR)	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	2376
טבלת בידוד רעידות	מערכות קינטיות	סדרת 9200
פאראדיי קייג'	מערכות קינטיות	לא ישים
מיקרוסקופ מנתח על בום	ניקון	SMZ800N	ניתן להשתמש בטווחים מרובים; מעמד בום הוא קריטי
מגבר דיפרנציאל AC/DC	אדינסוטרמנטים	AM3000H	ניתן להשתמש בדגם 1700 במקום בדגם 3000
צג שמע	אדינסוטרמנטים	AM3300
Hum Bug Noise Eliminator	מערכות A-M	726300
מערכת איסוף נתונים (PowerLab)	אדינסוטרמנטים	PL3504	ניתן להשתמש במספר דגמי PowerLab.
תוכנת Lab Chart Pro	אדינסוטרמנטים	N/A - הורדה מקוונת
נורות סיב אופטי	אדמונד אופטיקה	89-740	ניתן להשתמש במקורות אור שונים, אך סיבים אופטיים הם הסתגלנים ביותר
מיקרומניפולטור	מכשירים מדויקים בעולם	M325
מחזיק מיקרואלקטרודות	מכשירים מדויקים בעולם	MEH715	מודלים שונים מקובלים
כבלי BNC	מכשירים מדויקים בעולם	מרובים בהתבסס על גודל
נימי זכוכית	מכשירים מדויקים בעולם	PG52151-4
מושך מיקרואלקטרודות	סאטר אינסטרומנטס	P-1000	כמו כן יכול להשתמש Narashige PC-100
שעווה שחורה	קרולינה אספקה ביולוגית	974228
סיכות חרקים לא מצופות, גודל #2	ביוקוויפ	1208S2
מלקחיים פינס	כלים מדעיים משובחים	11254-20
מספריים קפיץ Vannas	כלים מדעיים משובחים	15000-03