כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. הכנת מערך MEA
הערה: התחל 15 דקות לפני ההקלטה.
- להעביר את הנפח הנותר של 4AP-ACSF (4-aminopyridine נוזל מוחי מלאכותי) לתוך בקבוק Erlenmeyer 500 מ"ל.
- הניחו את בקבוק Erlenmeyer על מדף מעל מגבר MEA (Microelectrode arrays) והשתמשו בצינורות כדי לאפשר לתמיסה להזין ברציפות מזרק של 60 מ"ל. כוונן את גובה בקבוק Erlenmeyer ואת המזרק כדי לאפשר קצב הזנה מכוח הכבידה של 1 מ"ל/דקה
הערה: הגובה הנכון תלוי בקוטר הפנימי של הצינור (ID). עבור צינורות של 5/32 אינץ 'ID, 30 ס"מ מספיק.
- התחילו לבעבע את 4AP-ACSF בבקבוק Erlenmeyer ובמזרק עם תערובת גז 95% O2/5% CO2.
- תן ל- 4AP-ACSF לזרום דרך צינורות הזילוח לתוך עד שאין אוויר בפנים; ואז עצור את זרימת התמיסה.
- חבר את גוף החימום בבסיס MEA לתרמוסטט. הניחו את שבב ה-MEA היבש בתוך מגבר MEA ואבטחו את ראש המגבר. פיפטת פסטר מפלסטיק מעבירה 4AP-ACSF לכניסה ולמאגר החיצוני של תא ההקלטה.
- הצמידו את צינורית החימום למחזיק מגנטי והניחו את קצהו בתוך פתח הכניסה של תא ההקלטה. חבר את המחזיק המגנטי לפס מגנטי בראש מגבר MEA. חברו את צינורית הזילוח לצינורית. חבר את הצינורית לתרמוסטט.
הערה: צינורית החימום צריכה להיות מכוסה בצינורות פוליטטרה-פלואוראתילן משופעים (PTFE) כדי להגיע ליציאת הכניסה של תא ההקלטה ולמזער את הרעש עקב החומר המתכתי שלה. כאשר מאגר הכניסה מלא כראוי ב- 4AP-ACSF, טיפות הנופלות ממערכת הזילוח לא אמורות להיות גלויות.
- מניחים את מחט היניקה בתוך המאגר ומוודאים שיש לחץ שלילי על ידי טבילתה לתוך ACSF; בדוק אם יש רעש יניקה קבוע בתדר נמוך.
הערה: יש למקם את מחט היניקה כך שה-4AP-ACSF יזרום בדיוק מעל פני השטח של פרוסת המוח. ניתן להשתמש בקו ואקום או במשאבת ואקום בעלת רעש נמוך.
- הגדר את וסת הזרימה כך שיאפשר קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה והתחל לבלבל.
הערה: זילוח המוזן מכוח הכבידה מבטל את הרעש שעלול להיגרם על ידי משאבות פריסטלטיות; אם משאבות פריסטלטיות מועדפות, מודלים רעש נמוך הם חובה.
- ברגע ש-4AP-ACSF זורם דרך הצינורית, הפעל את התרמוסטט. הגדר את צינורית החימום ל- 37 ° C ואת בסיס MEA ל- 32 ° C כדי להשיג טמפרטורה של 32 - 34 ° C בתוך תא ההקלטה.
הערה: זהירות! לעולם אל תחממו את הצינורית ללא תמיסה בתוכה, אחרת היא עלולה להינזק באופן בלתי הפיך. הגדר את טמפרטורת הצינורית גבוהה מטמפרטורת ההקלטה (כלומר, 32 - 34 ° C) כדי לקחת בחשבון את קיזוז הטמפרטורה הפנימי בין הערך שנקבע לבין הערך בפועל בקצה צינורית החימום ובתוך תא ההקלטה. קצב הזרימה, טמפרטורת הסביבה והנפח של תא ההקלטה משפיעים כולם על הטמפרטורה של תמיסת ההקלטה. ההגדרות המדווחות בשלב 1.9 ממוטבות עבור הפרוטוקול והציוד המתוארים. בדוק תמיד את טמפרטורת ההקלטה בפועל באמצעות זוג תרמי והתאם את ההגדרות לפי הצורך. אין לחמם את בסיס MEA מעל 34°C כדי למנוע חימום יתר של פרוסת המוח.
- מקם את אלקטרודת הייחוס החיצונית במאגר הכניסה של תא ההקלטה.
הערה: למרות שבבי MEA מצוידים באלקטרודת ייחוס פנימית, תא ההקלטה המותאם אישית מכסה זאת. לפיכך, יש להשתמש באלקטרודת ייחוס חיצונית. גלולת KCl רוויה (אשלגן כלורי) היא המעשית ביותר מכיוון שהיא מוכנה לשימוש ללא צורך בהכלרה.
2. מיפוי חי MEA
- לאחר ייצוב רמת 4AP-ACSF וטמפרטורת ההקלטה כרצונך, סובב את הזילוח ואת פקקי היניקה למצב כבוי כדי לעצור אותם באופן זמני.
- העבירו במהירות פרוסת מוח אחת לתא ההקלטה MEA באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית הפוכה. התאימו את מיקומו על אזור ההקלטה MEA לפי הצורך באמצעות פיפטת פסטר מסולסלת מלוטשת אש (איור 1C) או מברשת רכה וקומפקטית. הניחו את העוגן המוחזק (איור 1D) על פרוסת המוח. הפעל מחדש את הזילוח ואת היניקה על ידי סיבוב סטופקוקים שלהם בחזרה למצב מופעל.
הערה: קריטי! יש להעביר את הפרוסה ולהפעיל מחדש את הזילוח תוך 60 שניות, אחרת הרקמה עלולה למות. יש לשמור את עוגן החזקת הפרוסה ב-4AP-ACSF כדי למנוע מפרוסת המוח לזוז בזמן הנחת העוגן על פרוסת המוח עקב הבדלים במתח שטחי. העוגן לאבטחת פרוסת המוח על MEA יכול להיות מיוצר בהתאמה אישית באמצעות חוטי נירוסטה וחוטי ניילון (איור 1D) או ממקורות מסחריים. איור 1E מראה את מערך הניסוי הסופי עם שבב MEA המחובר לראש המגבר: פרוסת מוח שנחה על שבב MEA בתוך תא ההקלטה מוחזקת על ידי העוגן המותאם אישית. אלקטרודת הייחוס (עיגול אדום) וצינור ה-PTFE המכסה את צינורית החימום (חץ אדום) ממוקמים במאגר הכניסה, ואילו מחט היניקה (חץ כחול) ממוקמת במאגר היציאה.
- צלמו את פרוסת המוח באמצעות מצלמה המותקנת על במת מיקרוסקופ הפוך.
- הפעל את הסקריפט mapMEA בתוכנת המחשב כדי להפעיל את ממשק המשתמש הגרפי כדי למפות את האלקטרודות.
הערה: התוכנה בהתאמה אישית מאפשרת למשתמש לבחור את האלקטרודות התואמות מבנים ספציפיים של פרוסת המוח. שלב זה חיוני כדי להפעיל את המסלול הנכון ולדכא את הפעילות האיקטלית באמצעות גירוי חשמלי.
- לחץ על הלחצן Browse כדי לטעון את התמונה של פרוסת המוח. ודא שאלקטרודת הייחוס מופיעה בשורה העליונה של חצי הצד השמאלי של MEA (איור 2A, סימן משולש). לחץ/י על הכפתור ״הפעל מצביע״ ולאחר מכן בחר/י את האלקטרודות העליונות והתחתונות בשורה השמאלית ביותר של המערך כדי לסמן את קואורדינטות XY ליישור תמונה ולמיפוי אלקטרודות.
- בתפריט הנפתח של סוג פרוסה, בחר אופקי. סמן את תיבת הסימון מבני ברירת מחדל.
הערה: ניתן להתאים אישית את המבנים על ידי בחירה בלחצן הזן מבנים חדשים. מבני ברירת המחדל של פרוסת המוח האופקית מתוארים באיור 2A.
- בעזרת הלחצנים הממוספרים מתחת לתמונת פרוסת המוח, בחרו את האלקטרודות המתאימות להחזר ההשקעה ולחצו על הלחצן המתאים בחלונית המבנים כדי להקצות אותן (איור 2B); חזרו על שלב זה עבור כל החזר השקעה.
- לחץ על כפתור שמור: התוכנה יוצרת תיקיית תוצאות בשם #EXP_LabelledElectrodes המכילה טבלה המדווחת על האלקטרודות וה- ROI שנבחרו.
3. הקלטה ומודולציה חשמלית של פעילות אפילפטיפורמית
- הניחו לפרוסת המוח להתייצב בתוך תא ההקלטה למשך 5 - 10 דקות לפני ההקלטה.
- הפעל את יחידת הגירוי לפחות 10 דקות לפני פרוטוקול הגירוי כדי לאפשר כיול וייצוב עצמי. הפעל את תוכנת בקרת הגירוי וודא שהממריץ ומגבר MEA מחוברים כראוי, כפי שמצוין על-ידי נורית LED ירוקה בלוח הראשי של תוכנת בקרת הגירויים.
- הגדר את הגירוי בתצורה דו קוטבית. בחר זוגות אלקטרודות במגע עם שכבת התא הפירמידלית של CA1/proximal subiculum (cf.24,25) בין אלה שמופו עם הכתב mapMEA (ראה סעיף 12). השתמש בחוט כדי לחבר את אחת האלקטרודות שנבחרו לתקע השלילי של המגרה ואת האלקטרודה השנייה לתקע החיובי של אותו ערוץ גירוי. השתמש בחוט אחר כדי לחבר את הקרקע של הממריץ לקרקע של המגבר.
- הפעל את תוכנת ההקלטה. כדי להשיג נתונים, לחץ על כפתור PLAY בחלונית הראשית של תוכנת ההקלטה. רשום לפחות 4 הפרשות איקטאליות.
הערה: תדר דגימה של 2 קילוהרץ מאפשר השגת פוטנציאלי שדה ברזולוציה הוגנת תוך מזעור השימוש בשטח הדיסק הקשיח. קובץ הקלטה של 5 דקות לוקח ~ 80 MB. ייתכן שיידרשו תדרי דגימה גבוהים יותר, למשל, כדי להקליט תוצרי גירוי או פעילות מרובת יחידות. כדי לצפות בפוטנציאלי שדה בלבד, השתמש במסנן חי במעבר נמוך ב- 300 הרץ כדי לנתק פעילות מרובת יחידות.
- לקבוע את עוצמת הגירוי.
- בתוכנת בקרת הגירויים, השתמש בלוח הראשי כדי לתכנן משך פעימת זרם חיובי-שלילי ריבועי של 100 μs / phase.
הערה: זהירות! גירוי זרם ישיר דורש פולס מטען מאוזן כדי למנוע נזק לציוד.
- הפעל בדיקת קלט/פלט מהירה (I/O) כדי לזהות את עוצמת הגירוי הטובה ביותר. ספק את פעימת הגירוי שתוכננה בשלב 3.5.1 ב- 0.2 הרץ או פחות על-ידי הוספת מרווח בין פעימות של 5 שניות או יותר בצורה המתאימה של תוכנת בקרת הגירוי. בכרטיסייה משרעת דופק הזן משרעת פולס התחלתית של 100 μA / פאזה והגדל בשלבים של 50 - 100 μA בכל ניסוי עד שהגירוי יכול לעורר באופן אמין אירועים דמויי אינטריקטל בקליפת המוח הפארא-היפוקמפוסית (בדוק את האותות המדומים על ידי תוכנת ההקלטה).
- אפנון חשמלי של ictogenesis לימבי
- תכנת את יחידת הגירוי כך שתספק את פרוטוקול הגירוי המעניין. השתמש באמפליטודת הגירוי שזוהתה במהלך מבחן קלט/פלט.
הערה: שיעור הכישלון של תגובות מעוררות צריך להיות ≤20%.
- לאחר הפסקת הגירוי, ודא את שחזור הרשת למצב טרום גירוי על ידי רישום לפחות 4 הפרשות איקטליות (כמו בשלב 3.4).
