התנהגות ניווט של זחלי דרוזופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי של נוירוני חוש הריח

תקציר

מקור: Clark, D. A., et al. מעקב אחר התנהגות זחלי דרוזופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי של נוירוני ריח. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים מחקר על התנהגות הניווט של זחלי דרוזופילה בתגובה לגירוי אופטוגנטי של נוירונים חושי ריח (ORN). זחלי דרוזופילה טרנסגניים המבטאים תעלות יונים רגישות לאור ב-ORN ממוקמים על אגרוז בתוך זירת התנהגות. גירוי אופטוגנטי עם אור פותח את הערוצים, גורם לזרם קטיון שמפעיל את העברת האות למוח, והתנהגות הניווט נרשמת.

פרוטוקול

1. בניית זירת התנהגות והכנת חומרה שתאפשר גירוי אופטוגנטי בזירת ההתנהגות

1. כדי לבנות זירת התנהגות נטולת אור, בנו קופסה במידות של 89 x 61 x 66 ס"מ³ (אורך 35 אינץ' x רוחב 24 אינץ' x גובה 26 אינץ') עשויה מיריעות אקריליק פרספקס בצבע שחור (בעובי 3 מ"מ) (ראה טבלת חומרים). חומרים לבניית קופסה כזו צריכים להיות זמינים בחנויות חומרי בניין מקומיות. הניחו את התיבה הזו על משטח עליון בחדר ההתנהגות (איור 1A).
2. הרכיבו מצלמת CCD (ראשי תיבות של Universal Universal Serial Bus (USB) 3.0 עם אפיק טורי אוניברסלי בשחור-לבן (USB) המצוידת במסנן אינפרא-אדום (IR) בעל מעבר ארוך של 830 ננומטר ובעדשת הרכבה F1.4 C בגודל 8 מ"מ (ראו טבלת חומרים) במרכז התקרה של הקופסה השחורה. הניחו שתי רצועות דיודה פולטות אור אינפרא-אדום (LED) (ראו טבלת חומרים) על משטח השולחן כדי להאיר את הזחלים בזירה החשוכה (איור 1A).
3. כדי לבנות את פלטפורמת ה-LED, השג פלטת אלומיניום מרובעת בגודל 22 ס"מ × 22 ס"מ (רצוי ריסוס צבוע בגימור שחור מט כדי למנוע השתקפויות). במרכז הצלחת, באמצעות חותך מתכת, חותכים חור גדול מספיק כדי להתאים סביב מצלמת CCD.
4. כסו את לוח המתכת בנורות פס LED אדומות (ראו טבלת חומרים). הלחמה חוטי פס אור LED בסדרה ומזינים את חוטי הפסים לממסר מצמד אופטי הנשלט על-ידי מיקרו-מעבד Raspberry Pi 2B (ראו טבלת חומרים) (איור 1B ו-2).
5. התקן והגדר מערכת הפעלה מבוססת Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux על מעבד Raspberry Pi לפני חיבור ממסר המצמדים האופטיים לפסי ה-LED. חברו ספק כוח כדי להפעיל את פסי ה-LED ואת המצמד האופטי (איור 2) (ראו טבלת חומרים). הרכיבו את פלטפורמת ה-LED סביב מצלמת CCD (איור 1B).
   הערה: מערכת ההפעלה Ubuntu Mate v16.04 זמינה באופן חופשי. ניתן להתאים בקלות קבוצה של פקודות פשוטות מבוססות Python לתבניות תכנות של גירויי אור LED (ראה קובץ תחביר).
6. להבטיח הקרנה הומוגנית בנקודות שונות בזירת ההתנהגות. למדוד את הקרינה המוחלטת על פני השטח של הזירה בעזרת ספקטרומטר ולקבוע שזה ~ 1.3 W/m² בכל פני השטח של הזירה.
   הערה: בעוצמה זו לא נצפו שינויים משמעותיים בטמפרטורה במהלך הניסויים. מחקר אחר השתמש בקרינה גבוהה יותר של ~1.9 W/m² ולא הבחין בשינויים בטמפרטורה במהלך הניסויים.

2. הכנת זחלי דרוזופילה לניתוחי התנהגות

1. שמרו על הזבובים על מזון זבובים סטנדרטי (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 25°C, 50-60% לחות יחסית (RH), ומחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות.
2. על מנת לבטא CsChrimson בזוג יחיד של ORNs, הצליבו נקבות בתוליות מקו UAS-IVS-CsChrimson לזכרים מקו OrX-Gal4 ('X' מתאים לאחד מ-21 גנים של קולטן ריח הזחל (OR) המתבטאים באופן ייחודי בכל אחד מ-21 זוגות של ORN).
   1. לחילופין, על מנת לבטא CsChrimson בכל 21 הזחלים, יש לחצות נקבות בתוליות מקו UAS-IVS-CsChrimson לזכרים מקו Orco-Gal4 ('Orco' הוא קולטן המשנה המתבטא בכל 21 ORNs).
   2. השתמש בקו UAS-IVS-CsChrimson בפני עצמו כבקרה בניסויים אלה.
      הערה: מניות הזבובים המפורטות כאן זמינות כולן במרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (ראו טבלת חומרים).
3. ברגע שזבובים זכרים ונקבות בצלב מורשים להזדווג ולהטיל ביצים במשך 48 שעות, העבירו את הבוגרים לבקבוקון טרי.
   1. על פני השטח של בקבוקון המזון המכיל ביצים, להוסיף 400 μL של תערובת המכילה 400 μM all-trans retinal (ATR) מומס dimethyl sulfoxide (DMSO) ו 89 mM סוכרוז מומס במים מזוקקים.
      הערה: כמות קטנה של סוכרוז מקדם הזנת הזחלים של תמיסת ATR. ATR הוא קופקטור הנדרש להגברת הוויסות של ביטוי CsChrimson. ATR רגיש לאור.
   2. לאחר הוספת ATR לבקבוקוני המזון המכילים ביצים, לדגור על הבקבוקונים בחושך למשך 72 שעות < נוספות / > הערה: בעוד שמחקר זה ושני המחקרים לעיל לא הבחינו בהשפעות על התנהגות הזחלים עקב הזנת ATR, מומלץ לשלוט בהשפעות הזנת ATR על ידי הכפפת קווי הבדיקה לאותה כמות של התערובת לעיל שאינה מכילה ATR.
4. חלצו זחלי כוכב שלישי (~ 120 שעות לאחר הטלת ביצים) מפני השטח של מזון זבובים על ידי הצפתם באמצעות תמיסת סוכרוז בצפיפות גבוהה (15%). באמצעות מיקרופיפטה P1000 להפריד את הזחלים הצפים על פני השטח של תמיסת סוכרוז לתוך זכוכית 1000 מ"ל.
5. שטפו את הזחלים 3-4 פעמים על ידי החלפת 800 מ"ל מים מזוקקים טריים בכוס הזכוכית בכל פעם. אפשרו לזחלים לנוח במשך 10 דקות לפני שתחשפו אותם לבדיקת התנהגות.

3. בדיקת התנהגות

1. שמור על טמפרטורה עקבית (בין 22-25 ° C) ולחות (בין 50 ל 60% לחות יחסית) בחדר ההתנהגות.
2. מכינים זחל בינוני על ידי מזיגת 150 מ"ל של אגרוז מומס (1.5%) לתוך צלחת פטרי 22 ס"מ על 22 ס"מ מרובע. צלחת פטרי אחת נמזגת לכל ניסוי, 8-10 ניסויים לכל ניסוי. הניחו לאגרוז להתמצק ולהתקרר במשך 1-2 שעות בצלחות הפטרי לפני שתשתמשו בהן בבדיקת ההתנהגות.​
   1. העבירו לא יותר מ-20 מזחלי הכוכב השלישי שהוכנו מראש למרכז צלחת פטרי (איור 1C). מכסים את צלחת הפטרי במכסה. הניחו את צלחת הפטרי בזירת ההתנהגות תחת מצלמת CCD.
      הערה: בהתאם לניסוי, מבחני התנהגות מתבצעים בדרך כלל במשך 3-5 דקות. אם נעשה שימוש בריח בבדיקה כדי לספק רמזי הנחיה, נצפה כי שיפוע הריח המתקבל נשאר יציב במשך כ -5 דקות. זמני בדיקה ארוכים יותר אינם מומלצים. השפעות מזיקות על הזחלים עקב התייבשות או מחשיפה ממושכת לאור אדום של 630 ננומטר לא נצפו בנקודות זמן אלה.
3. הפעל את מקור אור LED אינפרא אדום 850 ננומטר כדי להמחיש זחלים בסרטון. הפעל את מצלמת CCD כדי להקליט את תנועת הזחל.
4. באמצעות התוכנה המשויכת למעבד Raspberry Pi, תכנת את ההליך לניהול דפוסים מתאימים של גירוי אור אדום.
   הערה: ניתן להתאים בקלות קבוצה של פקודות פשוטות מבוססות Python לתבניות תכנות של גירויי אור LED (ראה קובץ תחביר).

תוצאות

איור 1: זירת התנהגות ומדיום זחילה של זחלים. (A) מבט קדמי על זירת ההתנהגות של הקופסה השחורה. הדלת הפתוחה של הזירה חושפת מצלמת CCD התלויה מתקרת הקופסה. (B) מבט תחתון על משטח מתכת המכיל פסי תאורת LED אדומים המשמשים לגירויים אופטוגנטיים מותקן סביב מצלמת CCD. (C) מבט מלמעלה על אמצעי הזחילה של הזחל המשמש בבדיקה. לפני תחילת רישום תנועת הזחל, ~ 20 זחלים שטופים מונחים לאורך מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצלמת וידאו ללכידת תנועת הזחל
מצלמת CCD	אדמונד אופטיקה	106215
מתאם חוט מסנן M52 ל- M55	אדמונד אופטיקה	59-446
מחזיק מסנן בעל הברגה מרובעת בגודל 2 אינץ' לעדשות הדמיה	אדמונד אופטיקה	59-445
RG-715, מסנן מעבר ארוך בגודל 2 אינץ' רבוע	אדמונד אופטיקה	46-066
אלקטרוניקה להתקנה אופטוגנטית
פטל פאי 2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
ספק כוח ניתן לתכנות של 3 ערוצים	newegg.com	9SIA3C62037092
ממסר מצמד אופטי 8 ערוצים	amazon.com	6454319
630nm רצועות נורות LED עם ארבע שורות	environmentallights.com	אדום3528-450-סליל
פסי LED 850nm	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2-kit
תוכנה
אובונטו MATE v16.04	נובונטו	https://github.com/yslo/nubuntu
פריטים אחרים
פרספקס שחור אקריליק	הום דיפו	MC1184848bl
מזון זבובים וריאגנטים אחרים
מזון זבובים Nutrifly	ג'נסי סיינטיפיק	66-112
אבקת אגרוז	ג'נסי סיינטיפיק	20-102
צלחת פטרי מרובעת בגודל 22 ס"מ על 22 ס"מ	VWR בע"מ	25382-327
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D2650
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	84097
כל הטרנס-רטינל	סיגמא-אולדריץ'	₪600
זבובים
UAS-IVS-CsChrimson	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	55134
אורקו-גל4	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	26818
OR42A-Gal4	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	9970
Or7a-Gal4	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	23907