עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים בפרוסות היפוקמפוס עכבר

תקציר

מקור: Thalhammer, A., et al. שילוב אופטוגנטיקה עם מיקרו-רנ"א מלאכותי כדי לאפיין את ההשפעות של הפלה גנטית על תפקוד פרסינפטי בתוך מעגלים עצביים שלמים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים סינפטיים מעוררים בפרוסות מוח של עכבר בהיפוקמפוס. תאי העצב CA3 היו נגועים בווקטור נגיפי רקומביננטי בעל מבנה להבעת כתב פלואורסצנטי, תעלת קרום המופעלת על ידי אור, ומיקרו-רנ"א המווסת את הביטוי של תעלות סידן מגודרות מתח. לאחר הנחת פרוסה בתא הקלטה ותיקון תא עצב CA1 עם פיפטת הקלטה, נעשה שימוש בפעימות אור כדי לעורר את התעלה המופעלת על ידי האור, וכתוצאה מכך זרם יונים וליצור פוטנציאל פעולה. היעדר תעלות סידן מגודרות מתח בנוירונים CA3 מעכב שחרור מוליכים עצביים, מה שגורם לעיכוב של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים בנוירוני CA1 המחוברים סינפטית.

פרוטוקול

1. הערכת תפקידם של חלבונים פרסינפטיים במעגלים עצביים שלמים על ידי גירוי ממוקד של נוירונים שהופלו באמצעות אופטוגנטיקה

הערה: הפרוטוקול הבא דורש ניסיון קודם עם רישומים אלקטרופיזיולוגיים בפרוסות מוח חריפות וגישה למערך אלקטרופיזיולוגי.

הזרקה
1. סטריאוטקטית של וירוס רקומביננטי הקשור באדנו עם סרוטיפ פסיפס 1 ו-2 (rAAV1/2) לתוך המוח. קבע את הקואורדינטות הסטריאוטקטיות עבור אזור העניין במוח באמצעות אטלסים סטריאוטקטיים עבור מוח עכבר או חולדה.
   1. השתמש במושך מיקרופיפטות כדי למשוך מיקרופיפטות הזרקה עם שוקיים ארוכים של Ø 7-9 מיקרומטר; גזור את מיקרופיפטות ההזרקה על השוקיים עם מספריים. השתמש בטוש דק ובנייר גרף כדי למקם סימני כיול על מיקרופיפטות ההזרקה כל 2 מ"מ.
   2. להרדים את החיה עם isoflurane ולתקן אותו במנגנון סטריאוטקטי.
   3. שמור על החיה חמה לאורך כל הפעולה עם כרית חימום להגדיר על 37 מעלות צלזיוס.
   4. הגן על העיניים עם חומר סיכה עיני.
   5. לגלח את הפרווה על הראש עם סכין גילוח חשמלי.
   6. מורחים יוד פובידון על הראש המגולח בעזרת צמר גפן.
   7. תחת מיקרוסקופ מנתח, לבצע חתך קו האמצע.
   8. נקה את משטח הגולגולת עם ניצן כותנה, כדי להפוך את bregma ו lambda גלוי.
   9. מניחים את מיקרופיפטת ההזרקה למחזיק שלה. חבר את המחזיק לזרוע הסטריאוטקטית.
   10. קבע את קואורדינטות x ו- y של אתר ההזרקה ביחס לברגמה ו / או למדא.
   11. השתמש במקדחה כדי לדלל את הגולגולת מעל אזור המטרה.
       הערה: השתמש בתנועות מעגליות עדינות והימנע מקידוח דרך הגולגולת מכיוון שזה יפגע בפני השטח של המוח.
   12. אם יש דימום, לספוג דם מופרז עם נייר מגבת.
       הערה: דם מופרז יקשה לקבוע נכונה את קואורדינטת z.
   13. טען ≤2 μL של וירוס לתוך micropipette הזרקת על ידי פעולה נימית.
   14. הביאו את מיקרופיפטת ההזרקה לקואורדינטות x ו- y של אתר ההזרקה.
   15. מחשבים את קואורדינטת z מהדורה ומורידים את הפיפטה לאט לתוך המוח.
   16. כאשר מגיעים לקואורדינטת z, המתן 3 דקות כדי לאפשר התאמת רקמות.
   17. יש להפעיל לחץ חיובי נמוך באמצעות מזרק 1 מ"ל המחובר באמצעות צינור גמיש לחלק האחורי של המיקרופיפטה של ההזרקה. עקוב חזותית אחר מהירות הפליטה של הנגיף מהמיקרופיפטה של ההזרקה דרך מיקרוסקופ הדיסקציה והשתמש בסימני הכיול כנקודות ייחוס.
       הערה: יש להזריק את הנגיף בקצב איטי (<100 nL/min) כדי למנוע נזק לרקמות.
   18. כאשר ההזרקה הסתיימה, לחכות 5 דקות, למשוך את micropipette הזרקת על ידי 0.2 מ"מ, לחכות עוד 5 דקות, כדי למנוע זרימה חוזרת של הנגיף.
   19. הוציאו את המיקרופיפטה של ההזרקה לאט ולחלוטין מהמוח והשליכו אותה למיכל מלא אקונומיקה.
   20. מרטיבים את הגולגולת בתמיסה פיזיולוגית ותופרים את העור ב-3-4 תפרים.
   21. החל משחה gentamicin על הפצע.
   22. יש לשכן את בעל החיים בכלוב נקי עם כדורי מזון ותחת מנורת חום עד שהוא מתאושש לחלוטין.
2. ≥15 יום לאחר ההזרקה, ערפו את ראשיהם של בעלי חיים תחת הרדמה איזופלורנית עמוקה.
3. הכינו פרוסות מוח חריפות של אזור המוח המעניין באמצעות ויברטומה באמצעות תמיסת נוזל מוחי מלאכותי (aCSF) בגז (95% O₂, 5% CO₂), המכילה (ב-mM): 123 NaCl, 1.25 KCl, 1.25 KH₂PO₄, 1.5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 נתרן פירובט ו-18 גלוקוז (אוסמולריות מותאמת ל-300 mOsm). לדוגמה, אם המטרה היא לנתח שידור סינפטי מנוירונים פירמידליים CA3 ל- CA1, הכינו פרוסות קשת של היווצרות ההיפוקמפוס (בעובי 350 מיקרומטר).
   הערה: משלב זה ואילך לעבוד בתנאי תאורה חלשה כדי למנוע הפעלה של הבדיקה האופטוגנטית על ידי אור סביבתי.
4. תנו לפרוסות להתאושש במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C באותו aCSF בתא המיועד להחזקת פרוסות מוח. שמור את הפרוסות באותו תא פרוסת מוח בטמפרטורת החדר עד להקלטה.
   הערה: באמצעות תנאים אלה, פרוסות יכול להישמר בריא עד 6-8 שעות.
5. העבירו פרוסה אחת לתא הקלטה שקוע והתמזגו עם 2 מ"ל/דקה של אותו aCSF המשמש להתאוששות בתוספת 1.5 mM CaCl₂ (סה"כ Ca²⁺: 2.5 mM) וללא נתרן פירובט.
   הערה: פרוסות מוכנות ונשמרות בריכוז נמוך של Ca²⁺ (1 mM) כדי למזער רעילות. הקלטות מבוצעות ב 2.5 mM Ca²⁺ לטובת שחרור שלפוחית.
6. בדוק בקצרה את האות של כתב הפלואורסצנט המובע (למשל, TdTomato; איור 1B) כדי לוודא את המיקום ואת עוצמת הזיהום.
7. מלא אלקטרודת טלאי בתמיסה תוך-תאית המכילה (ב-mM): 110 K-גלוקונאט, 22 KCl, 5 NaCl, 0.5 אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA), 3 MgCl₂, 4 אדנוזין 5′-טריפוספט מלח מגנזיום (Mg-ATP), 0.5 גואנוזין 5'-טריפוספט מלח טריסודיום (Na_3-GTP), 20 K₂-קריאטין פוספט, 10 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid buffer מותאם עם KOH (HEPES-KOH, pH 7.28, 290 mΩ).
   הערה: השתמש אלקטרודת תיקון עם התנגדות פיפטה של 5-6 mΩ.
8. תחת תאורה אינפרא-אדומה, הגיעו לתצורת תא שלם אטום היטב מתא עצב המקבל קלט סינפטי מהנוירונים הנגועים. לדוגמה, אם תאי עצב פירמידליים מסוג CA3 היו נגועים, טלאו תאי עצב פירמידליים במערכת הפרוקסימלית עד האמצעית של אזור CA1 (איור 1C).
   הערה: התנגדות סדרה ניתן להשאיר ללא פיצוי, אבל זה צריך להיות קבוע נמוך (≤20 MΩ).
9. השתמש בפרמקולוגיה כדי לבודד את הזרמים הסינפטיים הנחקרים. לדוגמה, אם המטרה היא לחקור שידור סינפטי מעורר, לחסום שידור סינפטי מעכב עם 10 מיקרומטר bicuculline.
10. לעורר זרמים סינפטיים, לדוגמה, זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSCs), באמצעות לייזר כחול 473 ננומטר המחובר לסיב אופטי (Ø ≤250 מיקרומטר) הממוקם על הסומטה של תאי העצב הנגועים (למשל. CA3 נוירונים פירמידליים).
    1. התאם את אורך הגירוי למינימום, כדי להפחית את האפשרות לעורר יותר מפוטנציאל פעולה אחד לכל פולס אור. אם אתה משתמש ב- ChETA, הגדר אותו ל- 2 אלפיות השנייה.
    2. התאם את עוצמת הגירוי של הלייזר כדי להניב זרמים סינפטיים קטנים אך ניתנים לזיהוי ברור (משרעת שיא של ≤50 pA עבור EPSCs שנרשמה בפוטנציאל החזקה של -70 mV בין נוירונים פירמידליים CA3 ו- CA1; איור 1D). אם משתמשים ב- ChETA ובסיב אופטי בקוטר 250 מיקרומטר, עוצמות גירוי של 1-3 mW ביציאת הסיבים צריכות להיות מתאימות.
       הערה: אם לא ניתן לווסת את חוזק הלייזר, השתמש במסנני צפיפות ניטרלית.
    3. להאיר את אור הלייזר 473 ננומטר על הסומטה של הנוירונים הנגועים, אך לא על האקסונים שלהם. לדוגמה, להאיר את האור על סומטה CA3, והרחק מביטחונות שפר, כדי למנוע דה-פולריזציה ישירה של האקסונים.
    4. מרחו טטרודוטוקסין (TTX; 0.5 מיקרומטר), חוסם של תעלות נתרן, על הדגימה כדי לוודא שהתעלות מונעות פוטנציאל פעולה.
    5. בהקלטות שונות, החל חוסם סלקטיבי על הזרם הסינפטי הנחקר כדי לאשר שהגירוי הוא סלקטיבי.
       הערה: לדוגמה, יש למרוח EPSC בתיווך קולטן גלוטמט מסוג 2,3-dioxo-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo[f]quinoxaline (NBQX, 10 μM) על EPSCs מסוג α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)-type.
    6. השוו זרמים סינפטיים אופטיים וחשמליים באותה פרוסת מוח חריפה בתגובה לגירוי חוזר (≥2 גירויים ב-≤20 הרץ). יש לראות רמה דומה של הנחיה סינפטית או דיכאון בין גירוי חשמלי ואופטי בעת שימוש במיקרו-רנ"א בקרה (miR), ובכך להציע כי מנגנונים תאיים דומים מופעלים על ידי שני סוגי גירויים.
       הערה: השלבים לעיל נחוצים כדי להבטיח כי גירוי אופטי אינו גורם depolarization ישיר של boutons presynaptic, ובכך לעקוף כמה מנגנונים של שידור סינפטי.

תוצאות

איור 1. הערכת התפקיד של Ca_v2.1[EFa] ו-Ca_v2.1[EFb] בהיפוקמפוס המקומי על ידי גירוי ממוקד של נוירונים שהופלו עם אופטוגנטיקה. (A) סכימה של קלטת הביטוי של מבני rAAV המשמשים לזיהום in vivo. (B) חתך היפוקמפוס המראה כי פלואורסצנטיות TdTomato מוגבלת לאזור CA3 והתחזיות שלו. (C) תצורה ניסיונית: קרן לייזר הופנתה לסומאטה CA3, ורישומ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פרוסות מוח Prechamber	מכשיר הרווארד	BSC-PC
מצלמת CCD מבוססת imager	ביו-ראד	ChemiDoc™ MP
ריאגנטים של תרביות תאים	לייף טכנולוגיות
מקדחה	קדימות	K.1030
EGTA	סיגמא	E4378
משחה Gentamicin	בית מרקחת מקומי
גלוקוז	סיגמא	G7021
HEPES	סיגמא	54459
מיקרופיפטות הזרקה	נארישיגה	GD1
מלחים ודטרגנטים אנאורגניים	סיגמא
K 2-קריאטין פוספט	קלביוכם	237911
קלוקונט	פלוקה	60245
לייזר	טכנולוגיות לייזרגלו	LRS-0473-GFM-00100-03
קרום	אמרשם	פרוטראן™ 0.2 מיקרומטר NC
MgATP	סיגמא	A9187
מחזיק מיקרופיפטה	נארישיגה	IM-H1
מושך מיקרופיפטה	נארישיגה	PC-100
Na3GTP	סיגמא	G8877
נפירובט	סיגמא	P5280
חומר סיכה עיני	בית מרקחת מקומי	לקריגל
פובידון יוד	בית מרקחת מקומי	בטדין
מנגנון סטריאוטקטי	WPI
טטרודוטוקסין	טוקריס	1069	רעיל
ויברטומה	לייקה	VT1200S