מדידת פעילות עצבית בפרוסת מוח של עכבר לאחר דגירה ממושכת

תקציר

מקור: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (120), (2017)

סרטון זה מדגים טכניקה למדידת פעילות עצבית בפרוסות מוח של עכבר באמצעות דימות סידן ורישומים אלקטרופיזיולוגיים. על ידי ערבוב הרקמה עם יוני אשלגן ורישום שינויים בסידן תוך תאי באמצעות הדמיה דיגיטלית במהירות גבוהה, שיטה זו חושפת תגובות עצביות בזמן אמת.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. העמסת צבע סידן

1. בחר צבעי סידן על פי העדפת החוקר הבודד. כאן אנו משתמשים ב- Fluo-8AM או Fluo-4AM. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על צבעים אחרים: להמיס צבעי סידן ב- DMSO לתמיסה של 1 מילימטר וקופולימרים בלוק 1% (למשל, חומצה פלורונית-127) לנפח סופי של 50 μL וסוניקט למשך 10 דקות.
2. הוסף תמיסה ל- aCSF לריכוז סופי של 10 מיקרומטר, קופולימרים בלוק 0.01% עבור פרוסות מוח.
   1. עבור בעלי חיים בוגרים, (>12 שבועות), פיפט את הצבעים (50 μL) ישירות על פרוסות המוח, ולשמור במשך 75 דקות כדי לאפשר חדירה טובה יותר של הצבע לתוך השכבות העמוקות.
   2. כדי להבטיח חמצון נאות של הפרוסה השקועה במהלך הדגירה של הצבע, הכינו תא העמסת זכוכית עם מכסה סגור (צנצנת עגולה בקוטר 2.5 ס"מ, גובה 3.5 ס"מ) עם צבעי סידן מדוללים ב-2.5 מ"ל של aCSF. יש לחמצן ברציפות עם 95% O₂/5% CO₂. אין לבעבע.
3. לאחר העמסת הצבע, שטפו את הרקמה עם aCSF והעבירו אותה למערכת הדגירה, תוך הורדת הטמפרטורה לאט ל 15 - 16 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לשימוש ניסיוני.

2. הקלטות והדמיות אלקטרופיזיולוגיות

1. מניחים רקמה בתא הקלטה שקוע תחת מיקרוסקופ ומחוררים עם aCSF מחומצן בקצב זרימה של 4 - 5 מ"ל לדקה או ב- RT (~ 22 ° C) או בטמפרטורה פיזיולוגית (~ 35 ° C). החזיקו את הרקמה במקומה באמצעות "נבל" בהתאמה אישית, עשוי חוטי ניילון או זהב שנמתחו ומודבקים על פיסת זהב בצורת U או חוט פלטינה.
2. לאלקטרופיזיולוגיה:
   1. הכינו פיפטות הקלטה מזכוכית בורוסיליקט בקוטר 1.5 מ"מ (1.19 מ"מ ID) באמצעות מושך מיקרופיפטה להשגת התנגדות סופית של 5-6 MΩ.
   2. מלא את פיפטה עם 3 - 4 μL של תמיסה פנימית ולדמיין תאים תחת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית אינפרא אדום (IR-DIC) באמצעות מצלמת CCD. הפתרון התוך-תאי צריך להיות מותאם בקפידה לכל ניסוי כדי להשיג תוצאות ניסוי.
   3. מקם את פיפטה תוך שמירה על לחץ חיובי המופעל דרך יציאת יניקה על מחזיק פיפטה על קרום התא באמצעות מיקרומניפולטור. אין צורך בגירוד קרום קודם מכיוון שה- ILM הוסר מהרשתית. ברגע שהפיפטה נמצאת על התא, הפעילו לחץ שלילי עדין על הפיפטה כדי להשיג אטם ג'יגה-אוהם. לאחר מכן, לקרוע את קרום התא עם כמות קצרה של לחץ שלילי.
   4. בצע הקלטות זרם או מהדק מתח של כל התא באמצעות טכניקות סטנדרטיות לפי הצורך.
3. הדמיית סידן:
   1. עבור אורך גל עירור יחיד של Fluo-4, סנן אור עירור דרך מסנן פסים של 460 - 490 ננומטר ופלט אור דרך מסנן פסים של 515 - 550 ננומטר. השתמש במצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה להקלטה המהירה והרגישה ביותר. רכוש תמונות כנדרש.
   2. למדוד שינויים בפלואורסצנטיות כפונקציה של זמן או באורך גל יחיד (Fluo-4).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי	סיגמא אולדריץ' VETEC	V800372
אשלגן כלורי	סיגמא אולדריץ'	עמ' 9333
D-גלוקוז	סיגמא אולדריץ'	G5767
סודיום ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'	S6014
נתרן פוספט מונובייסיק	סיגמא אולדריץ'	S2554
מגנזיום כלורי	סיגמא אולדריץ'	M9272
סידן כלורי	סיגמא אולדריץ'	223506
דימתיל סולפוקסיד נטול מים	סיגמא אולדריץ'	276855
F-127 פלורוני בעל ספיגת UV נמוכה*	טכנולוגיות חיים	P-6867	פתרון 20% ב- DMSO
Fluo-4 AM	לייף טכנולוגיות	F23917
Fluo-8 AM	אבקאם	AB142773
מיקרוסקופ זקוף שלב קבוע	אולימפוס	BX51WI
מטרת המיקרוסקופ	אולימפוס	XLUMPlanFLN 20x/1.00W	פי 20
מטרת המיקרוסקופ	אולימפוס	LUMPlanFLN 60x/1.00W	פי 60
מצלמת CCD	אנדור	איקסון +
מגבר מהדק טלאי	התקנים מולקולריים	MultiClamp 700B
מערכת איסוף נתונים	התקנים מולקולריים	Digidata 1440A	מערכת Axon Digidata®
נימי זכוכית בורוסיליקט	סאטר אינסטרומנט ושות	BF150-86-10
מושך מיקרואלקטרודות	סאטר אינסטרומנט ושות	P-97	מושך מיקרופיפטה מסוג Flaming/Brown
תא הקלטה/זילוח	וורנר אינסטרומנטס	RC-40LP	תאי אמבטיה פתוחים בפרופיל נמוך
תוכנה	התקנים מולקולריים	pClamp 10.2
תוכנת Andor iQ Live Cell Imaging	אנדור	אנדור iQ3
בקר טמפרטורה	טכנולוגיית TE	TC-36-25 RS232