בדיקת קשרים מונוסינפטיים באמצעות תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין וטטרודוקסין

תקציר

מקור: Zhang, X. et al., בחינת קשרים מונוסינפטיים בדרוזופילה באמצעות תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים בדיקת קשרים מונוסינפטיים באמצעות זבוב מהונדס. לזבוב יש תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין ותעלות המופעלות באור אדום בנוירונים הפרה-סינפטיים שלו, אשר מעוררים אופטוגנטית להעביר אותות לנוירונים פוסט-סינפטיים.

פרוטוקול

1. הכנת זבובים וזיהוי מקדם GAL4 קווים

1. בחר קו מקדם GAL4 וחצה אותו עם זבובים הנושאים הן את טרנסגן UAS-NaChBac והן טרנסגן אופטוגנטי להפעלה.
   הערה: UAS-CsChrimson נבחר בשל המוליכות הגבוהה שלו והקלות שבה הוא מפעיל פוטנציאלי פעולה בתיווך תעלת נתרן (NaChBac) העמידה בפני טטרודוטוקסין (TTX). הן UAS-NaChBac והן UAS-CsChrimson זמינים ממאגר המניות של בלומינגטון.
2. הכינו רשתית all-trans כתמיסת מלאי באתנול (35 mM) ואחסנו את התמיסה במקפיא בטמפרטורה של -20°C.
3. ערבבו 28 מיקרוליטר של ציר זה בכ-5 מ"ל של מזון פתיתי תפוחי אדמה מיובש והוסיפו תערובת זו לחלק העליון של בקבוקון של מדיום דרוזופילה קונבנציונאלי.
4. לגדל זבובים בוגרים המבטאים csChrimson על מזון המכיל 0.2 mM all-trans-retinal במשך 1-3 ימים.

2. הכינו מלאי TTX

1. צור תמיסת מלאי של 1 mM TTX במים מזוקקים או נטולי יונים. אחסנו תמיסה זו במקרר מעבדה למשך מספר חודשים. בדוק את מדיניות המוסד בנוגע לאחסון TTX, מכיוון שמוסדות רבים מסווגים TTX כחומר מסוכן או מבוקר.

3. הכינו זבובים לאלקטרופיזיולוגיה

1. אספו זבובים בוגרים בני 1-3 ימים שגדלו על המזון עם כל הרשתית הטרנסית.
2. מכניסים את הזבובים לבקבוקון זכוכית. הניחו את הבקבוקון על קרח למשך דקה אחת כדי לשתק את הזבובים.
3. השתמש במלקחיים גסים כדי להכניס זבוב לתא הקלטה בהתאמה אישית. התא מורכב מלייזר מעגל בגודל 3 וחצי אינץ' החתוך מאקריליק בגודל 1/16 אינץ'. חותכים חור בגודל 3/4 אינץ' למרכז, שם מחובר רדיד אלומיניום מותאם אישית עם אפוקסי בעל 2 חלקים. נייר הכסף מכיל תקווה בצורת משולש שהזבוב מוכנס לתוכו.
4. מרחו שעווה או אפוקסי אולטרה סגול (UV) הניתן לריפוי סביב בעל החיים כדי לאבטח אותו היטב בתוך תא ההקלטה.
5. להאיר את ההכנה עם סיב אופטי צוואר אווז להדמיה תחת סטריאומיקרוסקופ. הגדר את סיבי צוואר האווז להארה אלכסונית על ידי התאמתם כך שיאירו את הזבוב ישירות מהצד.
6. התאם את רמת האור להגדרה הנמוכה ביותר האפשרית שעדיין מאפשרת הדמיה ברורה של הזבוב. עוצמת אור זו תשתנה בין ניסויים בודדים.
   הערה: ניתן להתאים פרוטוקול זה באמצעות שיטת עציץ מוח באתרו.
7. אחזר מלוחים להקלטה חיצונית. המלח מכיל ב-mM: 103 נתרן כלורי, NaCl, 3 אשלגן כלורי, KCl, 5 N-tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethane-sulfonic acid, 8 trehalose, 10 glucose, 26 סודיום ביקרבונט, NaHCO₃, 1 נתרן dihydrogen פוספט, NaH₂PO₄, 1.5 סידן כלורי, CaCl₂, ו-4 מגנזיום כלורי, MgCl₂ (מותאם ל-270-275 mΩ). המלח מבעבע עם 95% O₂/5% CO₂ (קרבוגן) ויש לו pH מותאם ל 7.3.
8. מניחים 4-6 טיפות של תמיסת מלח חוץ-תאית על הכנת הזבוב. בשלב זה, הגדל את רמת האור במיקרוסקופ דיסקציה לקבלת ראות טובה יותר.
9. השחזת חוט טונגסטן באמצעות אלקטרוליזה. כדי ליצור את החוט, הכינו תמיסה רוויה של אשלגן חנקתי, KNO₃ והפעילו כ-20 וולט של זרם חילופין (AC) תוך טבילת קצה החוט בתמיסה 20 פעמים למשך 100 מילישניות כל אחת עד לחידוד החוד. השתמש בחוט טונגסטן מושחז כדי להסיר את הקוטיקולה על ראש הזבוב ובכך לחשוף את המוח.
10. חשיפה נוספת של המוח על ידי הסרת קנה הנשימה וגופי השומן המקיפים אותו. אם אתם ניגשים לאונות האנטנה, השתמשו בחוט טונגסטן כפוף או בכלי דומה כדי לתחוב בעדינות את האנטנות מתחת לתא ההקלטה של נייר הכסף כדי להגביר את הראות. השתמש במלקחיים חדים כדי לקרוע בעדינות את מעטפת הגליה המכסה את אזור העניין שבו יבוצעו הקלטות.
11. העבר את תא ההקלטה למתקן האלקטרופיזיולוגיה. מיד להתחיל זילוח עם הקלטה חיצונית מלוחים מבעבע עם carbogen כדי לשמר את המוח. מאגר תמיסת המלח ממוקם מעל שלב המיקרוסקופ ומוזן בכוח הכבידה לתכשיר. השתמשו בקו ואקום ובבקבוק Erlenmeyer בנפח 2 ליטר כדי לאסוף את הפסולת במי מלח.

4. השג הקלטה של תא שלם

1. משוך פיפטות טלאי על מושך פיפטה מסחרי. עיין במדריך לקבלת הגדרות כדי להשיג פיפטה מתאימה עם התנגדות קצה ליד 7 mΩ.
2. הוסף 4 μL של תמיסת הקלטה פנימית לפיפטת תיקון. המלח הפנימי מורכב מ-140 אשלגן אספרטט, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), 4 מגנזיום אדנוזין טריפוספט (MgATP), 0.5 Guanosine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (Na₃GTP), 1 אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA), ו-1 אשלגן כלורי (KCl) ב-mM.
3. הגדר מגבר מהדק תיקון להקלטה של תא שלם. אפס את היסט המגבר והגדר את המגבר לספק פולסי בדיקה. כאן, מגבר מהדק תיקון מערכות AM 2,400 משמש.
4. הפעילו לחץ חיובי דרך פיפטה והתקרבו לתא. השתמש במיקרומניפולטור כדי לכוון את פיפטה וליצור קשר עם התא. שחררו לחץ חיובי. הגדר את פוטנציאל האחיזה של הממברנה ל -60 mV. הפיפטה צריכה ליצור חותם ג'יגה-אוהם עם קרום התא, כפי שמעיד זרם החזקת תת-פיקואמפ נמוך.
   הערה: אם אתם משתמשים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המכוון לתאים, נסו למזער את השימוש באור אפיפלואורסצנטי כדי למנוע הפעלת ChR2 ודיכאון סינפטי פוטנציאלי. כמו כן, המתן מספר דקות לפני החלת שלב 5.
5. הגדר את המגבר כך שיספק פעימות בדיקה מ- -50 mV ל- -60 mV. הגדרה זו סטנדרטית במגברי מהדק תיקון. פולסי בדיקה יחשפו ארעי קיבולי גדול המייצג את הזרם הדרוש לטעינת פיפטת התיקון. הסר מעברים קיבוליים על-ידי התאמת ידיות פיצוי הקיבולת ב- AM 2400 או במגבר דומה.
6. הפעל פולסים קצרים של לחץ שלילי כדי לקרוע את קרום התא ולקבל תצורה של התא כולו.
   הערה: תצורת תא שלם נצפתה כאשר יש עלייה גדולה במעברים הקיבוליים המראים את הקיבול של הנוירון. סביר להניח שתיצפה גם עלייה קטנה בזרם ההחזקה (קו הבסיס). הגדר את המגבר למצב המהדק הנוכחי וכוונן את פוטנציאל התא ל- -50 עד -60 mV.

5. בדיקת קישוריות סינפטית

1. הגדר את מערכת רכישת הנתונים (DAQ) להפעיל מנהל התקן דיודה פולטת אור (LED) כדי ליצור פולסים של אור. כאן, מערכת DAQ של National Instruments משמשת עם Matlab כדי להעביר אות אנלוגי למנהל התקן LED. עוצמת ה-LED מותאמת באמצעות האות האנלוגי לנהג. נורית ה-LED היא נורית LED באורך גל של 620-630 ננומטר.
2. מקם את נורית ה-LED האדומה החזקה ישירות מתחת לתכשיר. כוונן את עוצמת האור כך ש- 0.238 mW/mm² יגיע לזבוב.
3. הפעל נוירונים פרה-סינפטיים בזמן הקלטה מהתא הפוסט-סינפטי המעניין. להשיג הפעלת תאים באופן אופטיגני, פרמקוגנטי, או באמצעות גירוי עצבי. כאן, csChrimson ופולסים קצרים של אור אדום מוחלים.
   הערה: ניתן לנטר חיבורים סינפטיים במהדק הנוכחי כפוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSPs) או מהדק מתח כזרמים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSC). חיבור סינפטי אמור להיות גלוי לפני החלת TTX בתגובה לפולס אור של 40 אלפיות השנייה. אם לא נצפה קשר, אין זה סביר כי הנוירונים מחוברים באופן סינפטי או מונו או polysynaptically. פוטנציאל ההחזקה עשוי להיות מותאם כדי להדגיש קשרים מעוררים או מעכבים בהתאם.
4. אם נצפה חיבור במי מלח רגילים, הוסיפו TTX למערכת הזילוח כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרומטר. השתמשו במשאבה מחזורית כדי ללכוד את המלח ולעשות בו שימוש חוזר כדי לשמר TTX. המשאבה הפריסטלטית תמשוך את תמיסת המלח מהאמבטיה ותחזיר אותה למאגר המלח.
5. כוונן את מהירות המשאבה כדי לספק ואקום קבוע חזק שאינו מאפשר לרמת המלח באמבטיה לעלות ולרדת.
   הערה: היישום של TTX אמור לגרום להפסקת פעילות הדוקרנים בתא העצב המנוטר בתא כולו. זה מאשר כי מספיק TTX נוסף מלוחים.
6. החל פולסים קצרים של אור אדום (40 ms עבור כל פולס) שוב. בשלב זה, כל קשר סינפטי שנותר הוא ככל הנראה מונוסינפטי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
UAS-csChrimson	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	55135	משמש כמפעיל עצבי
UAS-NaChBac	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	9466	רגישות Resotores בתאים ב- TTX
טטרודוטוקסין	טוכריס	1078	ייתכן שיהיה צורך באישור מיוחד כדי לרכוש TTX מכיוון שהוא חומר מבוקר
כל טרנס-רטינל	סיגמא-אולדריכל טרנס-רטינל	₪600	דרוש קו-פקטור עבור channelrhodopsin
יריעת נירוסטה 321 ניתנת לריתוך, בעובי 0.002 אינץ', ברוחב 10 אינץ'	מקמאסטר קאר	3254K7	משמש להכנת מחזיק זבובים בהתאמה אישית. ניתן לחתוך רדיד אלומיניום מותאם אישית בלייזר pololu.com מקובץ ה- PDF שסופק
מיקרוסקופ דיסקציה	זיס	סטמי 2000-C	משמש לדיסקציה של הכנה
ווקסר	אלמור	Eectra Waxer 66000	משמש במהלך הנתיחה כדי לאבטח זבוב בנייר כסף
שעוות פרפין	אנונימי	4917217	בשימוש עם שעווה
מספר 5 מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	#5CO	משמש לדיסקציה ו desheathing
מספריים לדיסקציה	כלים מדעיים משובחים	15001-08	משמש להסרת חלקים מהציפורן במהלך דיסקציה
חוט טונגסטן	מערכות A-M	797500	השתמש עם אלקטרוליזה כדי ליצור מחטים מושחזות לדיסקציה
משאבה פריסטלטית	Simply Pumps (אמזון)	PM200S	למחזור TTX
בקר מהירות למשאבה פריסטלטית	Zitrades (אמזון)	לא ישים	בקר עמעום PWM עבור נורות LED או סרט, 12 וולט 8 אמפר, מתג אור בהירות מתכוונן בקר דימר DC12V 8A 96W עבור רצועת אור LED B
וסת אוויר דחוס מדויק Versa-mount	מקמאסטר קאר	1804T1	להפעלת לחץ חיובי במהלך תיקון
נימי זכוכית	מכשירים מדויקים בעולם	TW150F-3	עבור פיפטות תיקון
מד רב תכליתי	מקמאסטר קאר	3846K431	מד לווסת לחץ
מצלמה אלקטרופיזיולוגית	Dage MTI	IR-1000	כל מצלמה שעובדת בטווח IR (850 ננומטר) תעבוד. אינך רוצה להשתמש בתאורה אדומה מכיוון שזה יכול להפעיל csChrimson
נורית IR	תורלאבס	M850F2	להארה אלכסונית
סיב אופטי עבור IR LED	תורלאבס	M89L01	זוגות לנורית IR
עדשה אובייקטיבית	אולימפוס 40X	LUMPlanFLN	זה יכול לשמש על רוב microscipes ועובד היטב עבור הדמיה נוירונים זבוב.
LED ענבר	תורלאבס	M590L3d	להמחשת RFP ו- mCherry
נורית LED כחולה	תורלאבס	M470L3d	להמחשת GFP
ערכת מסנן GFP	כרומה	49011	להמחשת GFP או לגירוי channel2rhodopsin
ערכת מסנן mCherry מותאמת אישית	כרומה	ET580/25X ו-T600LPXR (מקבוצת 49306) אך עם מחסום ET610LP/פליטה אופטית	השתמש רק אם ברצונך לתקן נוירונים מזוהים עם channel2rhodopsin
Dichroic לשלב ענבר וכחול LED	תורלאבס	DMLP550R	השתמש רק תיקון תחת mCherry ולעורר channel2rhodopsin עם אור כחול.
נורית LED אדומה	לד	Cree XPE 620 - 630 נאנומטר	משמש לנהיגה csChrimson
מנהל התקן LED	לד	3021-D-E-1000	משמש להנעת נורות LED לגירוי אופטוגנטי
מניפולטור	סאטר אינסטרומנטס	MP-225	משמש למיקום פיפטה במהלך הקלטות
מגבר Patchclamp	מערכות A-M	דגם 2400	מתאים מגבר מקביל
המסנן 'בסל	וורנר אינסטרומנטס	LPF 202A	מסנן עזר המשמש לסינון מעקב זרם לאוסילוסקופ במהלך תיקון.
מערכת איסוף נתונים	מכשירים לאומיים	NI PCIe-6321 781044-01	משמש להקלטת נתונים מהמגבר למחשב
בלוק מחבר - מסוף BNC BNC-2090A	מכשירים לאומיים	779556-01	משמש לחיבור מגבר לכרטיס DAQ.
רדיד פלדה	מקמאסטר קאר	3254K7	רדיד פלדה לתא הקלטה מותאם אישית
מגנטים	K&J מגנטיקה	D42	כדי לאבטח את תא ההקלטה למעמד הצלצול
1/16" תא יצוק אקריליק שקוף	פולולו		משמש להכנת תא הקלטה מותאם אישית. ניתן לחתוך אקריליק בלייזר pololu.com מקובץ ה-PDF שסופק