בדיקת קשרים מונוסינפטיים באמצעות תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין וטטרודוקסין

תקציר

מקור: Zhang, X. et al., בחינת קשרים מונוסינפטיים בדרוזופילה באמצעות תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים בדיקת קשרים מונוסינפטיים באמצעות זבוב מהונדס. לזבוב יש תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין ותעלות המופעלות באור אדום בנוירונים הפרה-סינפטיים שלו, אשר מעוררים אופטוגנטית להעביר אותות לנוירונים פוסט-סינפטיים.

פרוטוקול

1. הכנת זבובים וזיהוי מקדם GAL4 קווים

1. בחר קו מקדם GAL4 וחצה אותו עם זבובים הנושאים הן את טרנסגן UAS-NaChBac והן טרנסגן אופטוגנטי להפעלה.
   הערה: UAS-CsChrimson נבחר בשל המוליכות הגבוהה שלו והקלות שבה הוא מפעיל פוטנציאלי פעולה בתיווך תעלת נתרן (NaChBac) העמידה בפני טטרודוטוקסין (TTX). הן UAS-NaChBac והן UAS-CsChrimson זמינים ממאגר המניות של בלומינגטון.
2. הכינו רשתית all-trans כתמיסת מלאי באתנול (35 mM) ואחסנו את התמיסה במקפיא בטמפרטורה של -20°C.
3. ערבבו 28 מיקרוליטר של ציר זה בכ-5 מ"ל של מזון פתיתי תפוחי אדמה מיובש והוסיפו תערובת זו לחלק העליון של בקבוקון של מדיום דרוזופילה קונבנציונאלי.
....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
UAS-csChrimson	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	55135	משמש כמפעיל עצבי
UAS-NaChBac	מרכז בלומינגטון דרוזופילה סטוק	9466	רגישות Resotores בתאים ב- TTX
טטרודוטוקסין	טוכריס	1078	ייתכן שיהיה צורך באישור מיוחד כדי לרכוש TTX מכיוון שהוא חומר מבוקר
כל טרנס-רטינל	סיגמא-אולדריכל טרנס-רטינל	₪600	דרוש קו-פקטור עבור channelrhodopsin
יריעת נירוסטה 321 ניתנת לריתוך, בעובי 0.002 אינץ', ברוחב 10 אינץ'	מקמאסטר קאר	3254K7	משמש להכנת מחזיק זבובים בהתאמה אישית. ניתן לחתוך רדיד אלומיניום מותאם אישית בלייזר pololu.com מקובץ ה- PDF שסופק
מיקרוסקופ דיסקציה	זיס	סטמי 2000-C	משמש לדיסקציה של הכנה
ווקסר	אלמור	Eectra Waxer 66000	משמש במהלך הנתיחה כדי לאבטח זבוב בנייר כסף
שעוות פרפין	אנונימי	4917217	בשימוש עם שעווה
מספר 5 מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	#5CO	משמש לדיסקציה ו desheathing
מספריים לדיסקציה	כלים מדעיים משובחים	15001-08	משמש להסרת חלקים מהציפורן במהלך דיסקציה
חוט טונגסטן	מערכות A-M	797500	השתמש עם אלקטרוליזה כדי ליצור מחטים מושחזות לדיסקציה
משאבה פריסטלטית	Simply Pumps (אמזון)	PM200S	למחזור TTX
בקר מהירות למשאבה פריסטלטית	Zitrades (אמזון)	לא ישים	בקר עמעום PWM עבור נורות LED או סרט, 12 וולט 8 אמפר, מתג אור בהירות מתכוונן בקר דימר DC12V 8A 96W עבור רצועת אור LED B
וסת אוויר דחוס מדויק Versa-mount	מקמאסטר קאר	1804T1	להפעלת לחץ חיובי במהלך תיקון
נימי זכוכית	מכשירים מדויקים בעולם	TW150F-3	עבור פיפטות תיקון
מד רב תכליתי	מקמאסטר קאר	3846K431	מד לווסת לחץ
מצלמה אלקטרופיזיולוגית	Dage MTI	IR-1000	כל מצלמה שעובדת בטווח IR (850 ננומטר) תעבוד. אינך רוצה להשתמש בתאורה אדומה מכיוון שזה יכול להפעיל csChrimson
נורית IR	תורלאבס	M850F2	להארה אלכסונית
סיב אופטי עבור IR LED	תורלאבס	M89L01	זוגות לנורית IR
עדשה אובייקטיבית	אולימפוס 40X	LUMPlanFLN	זה יכול לשמש על רוב microscipes ועובד היטב עבור הדמיה נוירונים זבוב.
LED ענבר	תורלאבס	M590L3d	להמחשת RFP ו- mCherry
נורית LED כחולה	תורלאבס	M470L3d	להמחשת GFP
ערכת מסנן GFP	כרומה	49011	להמחשת GFP או לגירוי channel2rhodopsin
ערכת מסנן mCherry מותאמת אישית	כרומה	ET580/25X ו-T600LPXR (מקבוצת 49306) אך עם מחסום ET610LP/פליטה אופטית	השתמש רק אם ברצונך לתקן נוירונים מזוהים עם channel2rhodopsin
Dichroic לשלב ענבר וכחול LED	תורלאבס	DMLP550R	השתמש רק תיקון תחת mCherry ולעורר channel2rhodopsin עם אור כחול.
נורית LED אדומה	לד	Cree XPE 620 - 630 נאנומטר	משמש לנהיגה csChrimson
מנהל התקן LED	לד	3021-D-E-1000	משמש להנעת נורות LED לגירוי אופטוגנטי
מניפולטור	סאטר אינסטרומנטס	MP-225	משמש למיקום פיפטה במהלך הקלטות
מגבר Patchclamp	מערכות A-M	דגם 2400	מתאים מגבר מקביל
המסנן 'בסל	וורנר אינסטרומנטס	LPF 202A	מסנן עזר המשמש לסינון מעקב זרם לאוסילוסקופ במהלך תיקון.
מערכת איסוף נתונים	מכשירים לאומיים	NI PCIe-6321 781044-01	משמש להקלטת נתונים מהמגבר למחשב
בלוק מחבר - מסוף BNC BNC-2090A	מכשירים לאומיים	779556-01	משמש לחיבור מגבר לכרטיס DAQ.
רדיד פלדה	מקמאסטר קאר	3254K7	רדיד פלדה לתא הקלטה מותאם אישית
מגנטים	K&J מגנטיקה	D42	כדי לאבטח את תא ההקלטה למעמד הצלצול
1/16" תא יצוק אקריליק שקוף	פולולו		משמש להכנת תא הקלטה מותאם אישית. ניתן לחתוך אקריליק בלייזר pololu.com מקובץ ה-PDF שסופק