השתלת מערכת אלקטרודות על הראש במודל חולדה לזיהוי פרכוסים בזמן אמת

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. ייצור אלקטרודות הגירוי

1. כדי ליצור אלקטרודת גירוי אחת, חתכו שש חתיכות באורך 10 ס"מ של חוטי חיבור מיניאטוריים, הסירו 2 ס"מ מהחיפוי בקצה אחד ו-1 ס"מ בקצה השני.
2. סובבו שני כבלים זה לזה והלחכו אותם בצד הקלוף הקצר יותר.
3. רכוש רצועה של אריזה תלת קלטת של כל מעגל משולב עם מארז SOT-353 (Small Outline Transistor-353).
4. תפרו את החוטים המעוותים דרך שלושת החורים של החבילה. החלק הקלוף הארוך יותר של החוטים צריך להיות בחללי האריזה. מקמו את הכבלים כך שקצה הבידוד יהיה בקו אחד עם קצה החורים.
5. שים את מלט השיניים בחורים כדי לתקן את החוטים.
   זהירות: המלט הדנטלי חייב להיות צפוף מספיק כדי למנוע דליפה לתוך חלל האריזה.
6. לאחר שהמלט מתמצק (מינימום 10 דקות), הופכים את האריזה ומכניסים שכבה דקה של דבק-על לתוך החור כדי ליצור אטם אטום למים לכיוון המלט הנקבובי. הימנעו מהדבקת החוטים המקולפים.
7. סובבו את הכבלים יחד בצד המקולף הקצר יותר והלחמתו אותם (איור 1A).
8. תפסו את החלק הארוך והמקולף של החוטים בעזרת קצה של פינצטה עדינה, גלגלו אותם ועטפו אותם לתוך החללים (איור 1B). במידת הצורך, לחתוך את הכבל העודף.

2. ייצור אלקטרודות ההקלטה

1. כדי ליצור אלקטרודת שלישייה אחת (איור 1C-D), חתכו חתיכה באורך סנטימטר אחד של צינור נירוסטה באמצעות מסור סיבובי במהירות גבוהה. הסר את הסנפיר מקצות הצינור באמצעות מחט חדה וודא שהצינור נקי מפסולת וחדיר לחלוטין.
   הערה: אין להשתמש בצבת, מכיוון שהם יעוותו את הצינור.
2. כופפו סיכת ספייסר לוח מצופה זהב באורך מינימלי של 3 ס"מ ליצירת מחזיק בצורת J. חתכו את הרגל הארוכה יותר של צורת ה-J והלחכו אותה יחד כדי לקבל בחזרה את הצורה המקורית כדי ליצור חיבור ניתק בין החלק הליניארי הארוך, שיוחזק על ידי המכשיר הסטריאוטקסי, לבין צורת ה-U, שתחזיק את האלקטרודה, ותשמש כנקודת עיגון. הדביקו יחד את הצינור ואת הרגל הקצרה יותר של מחזיק האות J. מדביקים מוטות נוספים באורך 1 ס"מ, במידת הצורך, ליציבות.
3. חותכים 3 חתיכות של חוטי אלקטרודה באורך 2.5 ס"מ עם מספריים דקים במיוחד מנירוסטה. יש לוודא כי החתך ברור וחד וכי הבידוד תקין במשטח העגול של חוט האלקטרודה. כמו כן, ודא כי קצה לחתוך אינו כפוף בשל הכוח שהופעל. כופפו 1 או 2 מ"מ בקצה אחד של כל אחד מהחוטים בזוויות שונות (למשל, אחד שמאלי ישר, אחד 45°, וזווית אחת ישרה) כדי להבדיל ביניהם.
4. מלא את הצינור בחוטים. בחר מרווח מתאים של האלקטרודות לניסוי (לדוגמה, עבור רישום פוטנציאל שדה מקומי קליפת המוח (LFP) וצפיפות מקור נוכחית (CSD), הבליטה המומלצת של קצות החוטים מפתח הצינור היא 4.5 מ"מ, 4.1 מ"מ ו-3.7 מ"מ, בהתאמה). שים לב איזה חוט מתאים לאיזה עומק לשמירה על סדר ערוצים תקין.
5. ברגע שהחוטים מתיישרים ממש אחד ליד השני ומקבילים לצינור, כדי לתקן את חוטי האלקטרודה, הניחו טיפה אחת של דבק-על נוזלי בשני קצוות הצינור עם מחט חדה. יש לוודא שהדבק זורם לתוך הצינור בשל אפקט הנימים, אך לא לכיוון אתרי ההקלטה בקצוות הבולטים.
6. הכן לוח ממשק אלקטרודות עם מיקרו-מחבר מתאים התואם למערכת ההקלטה בה יש להשתמש.
7. הכנס את הקצוות שאינם מקליטים, המכופפים של החוטים לתוך החורים של לוח ממשק האלקטרודות המתאים לערוץ ההקלטה הרצוי. כאשר כל החוטים במקומם, דחפו את סיכות הזהב לתוך החורים עם פינצטה.
   הערה: ניתן לקבע סיכות זהב במקומן באמצעות מלט דנטלי, אך ברוב המקרים הן יציבות מספיק ללא שלב בטיחות זה.

3. הרדמה

1. הכניסו את בעל החיים לתא השראת הרדמה אטום ומלאו אותו ב-4-5% איזופלורן באוויר רפואי של 2 ליטר/דקה.
2. כאשר החולדה שוכבת, הוציאו את החיה מהחדר והניחו אותה במסגרת סטריאוטקסית עם אף אוורור מתאים.
3. הגדר את רמת האיזופלורן ל -2%, אם כי קצב זרימת האוויר צריך להישאר זהה. בדוק את רמת ההרדמה. אם יש היעדר של רפלקס נסיגה כף בתגובה צביטה, המשך, אחרת להגדיל את עומק ההרדמה.
4. נטר ושמור על טמפרטורת הגוף של החולדה ב 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס עם מערכת ניטור הומיאותרמית. החל טיפה של משחת פרפין על העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית. חזור על הליך זה מספר פעמים במהלך הניתוח, במידת הצורך.
5. יש להזריק אטרופין בתת עורית של 0.3 מ"ג/ק"ג כדי למנוע היווצרות ליחה בדרכי הנשימה. עבור ניתוחים ארוכים יותר, חזור על פעולה זו כל ארבע שעות. יש לעקוב אחר הנשימה ולכוונן את מכשיר האידוי, במידת הצורך.

4. השתלת אלקטרודות הגירוי וההקלטה

הערה: Autoclave כל כלי הניתוח הדרושים בזהירות בצע את הכללים הכלליים של asepsis ו antisepsis במהלך כל ההליך. יש להימנע מלגעת באזורים לא סטריליים מחוץ לאזור הניתוח. יש לטבול את האלקטרודות באתיל-אלכוהול (70%) למשך 30 דקות לפני ההשתלה.

1. הסירו את רוב השיער מהקרקפת בעזרת קוצץ שיער. יש למרוח קרם אפילציה על הקרקפת, למרוח אותו באופן שווה על פני השטח ולהמתין מספר דקות. השתמשו במרית כדי להסיר בעדינות את הקרם ואת השיער שנותר. לשטוף את העור עם מים, ולאחר מכן עם חומר חיטוי.
2. יש להזריק 1-2% לידוקאין (אין לחרוג מהמינון הכולל של 7 מ"ג/ק"ג) באופן תת-עורי כדי להרדים את העור. יש למרוח טיפה אחת של משחה וטרינרית על העיניים (למשל, פרפין).
3. בצע חתך סגיטלי יסודי וארוך (~ 2 ס"מ) בקו האמצע עם אזמל מהמצח לצוואר. לנתח את הרקמות, כולל periosteum, מן הגולגולת. לאחר מכן, באמצעות אזמל או פינצטה שיניים, לנקות את האזור בין cristae של שתי עצמות טמפורלית. הסירו את העור המנותח באמצעות ארבעה בולדוגים כדי לשמור על הגולגולת חשופה.
4. מניחים בעדינות פינצטה עדינה בין הקצה התלול של העצם הטמפורלית לבין השרירים ומפרידים ביניהם. בצע תנועות נענוע כדי לחשוף כמה שיותר משטח גדול של העצם הטמפורלית, רצוי מקצה העצם העורפית למישור התפרים העטרתיים, מבלי לפגוע בשרירים.
5. הניחו את המסירים באופן דו-זמני כדי לשמור על העצמות הטמפורליות חשופות.
6. לשטוף את פני השטח של הגולגולת עם 1 - 2 מ"ל 3% מי חמצן (H₂O₂), ולאחר מכן לשטוף אותו עם 1 - 2 מ"ל מים.
7. באוויר - יבש את פני השטח של העצמות הטמפורליות בזהירות רבה, לנקות את הלחות עם מקלות העין. בדוק אם אלקטרודות הגירוי מתאימות למשטח הגולגולת האנכי הנקי (הקצה העליון של אלקטרודת הגירוי צריך להיות בקו אחד עם קצה הקריסטה של העצם הרקתית). במידת הצורך, התאימו מחדש את הבולדוגים ואת המחזירים או עצבו את אלקטרודות הגירוי במספריים.
8. ממלאים את החללים של אלקטרודות הגירוי בג'ל אלקטרו-מוליך ומניחים שכבה דקה של דבק על שפת האלקטרודות.
9. הניחו את אלקטרודת הגירוי על המשטח היבש של העצם הטמפורלית בתנועה מדויקת אחת והחזיקו אותה במקומה למשך דקה אחת בפינצטה עדינה. יש לוודא כי אין לחות במגע עם הדבק. לנגב עם מקלות עיניים, במידת הצורך.
   זהירות: אם האלקטרודה הופכת לא יציבה, הסר אותה. לאחר ניקוי העצם, חזור על שלב זה עם אלקטרודת גירוי חדשה.
10. הניחו מלט דנטלי על שולי אלקטרודת הגירוי, וייבשו ללא הרף את הלחות הדולפת ברקמות בעזרת מקלות עיניים. לאחר מכן, לכסות את כל אלקטרודת גירוי עם מלט.
11. לאחר שהמלט מתקשה לחלוטין, חזור על שלבים אלה בצד הנגדי.
12. קדח כמה חורים בכל רחבי הגולגולת לעיגון ברגים. דחפו ברגים מיניאטוריים לתוך החורים והניחו עליהם מלט דנטלי. השתמש בראש מקדח בקוטר ~ 10% קטן יותר בהשוואה לקוטר הבורג.
13. בהתאם למטרת הניסויים, או לרתך מחבר לקצות הכבלים, להניח אותו על פני השטח ולכסות אותו במלט, או להמשיך להשתיל אלקטרודות הקלטה וסיבים אופטיים, או להכין חלון גולגולת מעל הגולגולת. במקרה אחרון זה, הלחמת את המחברים ולעגן אותם למבנה רק בסוף. במקרה של צורך בהקלטות TES ו-LFP סימולטניות ארוכות טווח, השתילו את שלישיות האלקטרודות הנ"ל במקום חוטים בודדים.
    הערה: הגדרה זו מאפשרת הסרה של חפצי גירוי במצב נפוץ8. לפרטים על הקלטת השתלת אלקטרודות, ראו פרוטוקולים קודמים.
14. לשטוף את הרקמות החשופות בשפע עם חומר חיטוי. תת עורית להזריק 1 - 2% לידוקאין (לא יעלה על מינון כולל של 7 מ"ג / ק"ג).
15. יש לפרק את קצוות הפצע ולסגור אותם באמצעות תפרים פשוטים וקטועים סביב המחבר/השתל. לאחר מכן, לחטא את הפצע עם povidone-יוד.
16. להזריק 5 מ"ג / ק"ג carprofene תת עורית. חזור על פעולה זו במידת הצורך.
    הערה: ניתן להשתמש בכל משככי כאבים אחרים, בהתאם לדרישות שנקבעו על ידי מועצת ההרשאות האתית המקומית.
17. יש להשהות את ההרדמה, לשחרר את מוטות האוזניים והאף ולהכניס את בעל החיים לכלוב התאוששות לאחר הניתוח כדי לחזור להכרה.
18. ודא כי בעל החיים נמצא תחת השגחה צמודה בשעות הראשונות שלאחר הניתוח. המשך לעקוב אחר אזור השתל מעת לעת.
    הערה: אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. לשכן את בעל החיים בנפרד עד שהוא מתאושש לחלוטין מההליך.

איור 1: שלבים של גירוי ורישום ייצור אלקטרודות. (א) חוטים מפותלים נתפרו דרך החורים וקובעו לאריזה לפני עטיפת החוטים המקולפים לתוך החללים. (B) הצורה הסופית של אלקטרודות הגירוי. כניסה: חוטים עטופים בתוך האריזה; (ג) מבט מהצד על אלקטרודות ההקלטה; (D) מבט מלמעלה על אלקטרודות ההקלטה. כניסה: קצה אתרי ההקלטה, מרווח של 400 מיקרומטר. (E) תמונה תוך ניתוחית של מיקום אלקטרודת הגירוי התוך גולגולתי. אלקטרודות הגירוי כבר מושתלות, יחד עם חלק מברגי העגינה.