הקלטת זרמים סינפטיים בצומת הנוירומוסקולרית של זחל דרוזופילה

תקציר

מקור: Vasin, A., et al. הקלטות מוקדיות של זרמים סינפטיים מצומת נוירומוסקולרית של זחל דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את הטכניקה להקלטת זרמים סינפטיים מבוטון סינפטי בצומת העצבית-שרירית של זחל דרוזופילה. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפעילות של בוטון סינפטי יחיד, החשוב לחקר קווי זבובים מוטנטיים בעלי פעילות סינפטית ספונטנית או אסינכרונית מוגברת.

פרוטוקול

1. ייצור אלקטרודות הקלטה

1. משיכת אלקטרודות הזכוכית
   1. השתמש בפרוטוקול הבא עבור מושך מיקרואלקטרודות (ראה טבלת חומרים):
      1. קו 1: חום 510 משיכה - מהירות 30 זמן 250; קו 2: חום 490 משיכה - מהירות 30 זמן 250.
         הערה: יחידות זמן מתאימות ל -0.5 אלפיות השנייה ליחידה; היחידות האחרות הן יחסיות. יש להתאים את ערך החום לכל חוט להט לאחר ביצוע בדיקת הרמפה.
   2. השתמשו במיקרוסקופ (הגדלה של פי 35) כדי להבטיח שהקוטר הפנימי של האלקטרודה המושכת הוא בטווח של 7-10 מיקרומטר (איור 1A). אחסנו את הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק.
2. ליטוש אש
   1. נימי פוליש אש (80 - 90% מערך החום המרבי עבור 1 - 2 שניות) באמצעות מיקרו-פורג' (ראה טבלת חומרים). ודא שהקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה המלוטשת הוא 5 מיקרומטר (איור 1A).
3. Bending
   הערה: שתי כפיפות נעשות על מנת למקם את האלקטרודה בחלק העליון של השריר תחת מטרת הגדלה גבוהה.
   1. השתמשו במכשיר שמוצג באיור 1B. תקן את האלקטרודה במניפולטור ומקם את הקצה מעל חוט הלהט, לא לגעת בו.
   2. הגדר את ערך החום ל- 60 - 70% מהמקסימום ולחץ על הדוושה של המיקרו-פורג למשך 1 - 2 שניות (ראה טבלת חומרים) כדי לחמם את חוט הלהט. השתמשו במחט בצורת L כדי למשוך בעדינות מטה את קצה האלקטרודה (איור 1B מוגדל). בצעו את העיקול בערך ב-90 מעלות צלזיוס (איור 1C).
   3. החזיקו את האלקטרודה מעל להבת הלפיד ביד באמצעות מלקחיים ובצעו את הכיפוף השני במרחק של 7-10 מ"מ מהעיקול הראשון ובזווית של כ-120^מעלות (איור 1C).

2. שלבי הכנה נוספים

1. הכנת תמיסה דמוית המולימפה (HL3) (במ"מ): 70 נתרן כלורי (NaCl), 5 אשלגן כלורי (KCl), 20 מגנזיום כלורי (MgCl₂), 10 נתרן מימן פחמתי (NaHCO₃), 5 טרהלוז, 115 סוכרוז, 5 N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N'-2-חומצה אתנסולפונית (HEPES), ו-1 mM סידן כלורי (CaCl₂); כוונן את ה- pH ל- 7.3 - 7.4. שמרו את התמיסה במקרר והפכו אותה לטרייה מדי שבוע.
2. צור פייפטים לגירוי באותו אופן כמו פייפט זכוכית הקלטה, אלא שאין צורך לכופף אותם.
   הערה: הכנת אלקטרודות גירוי מתוארת בפירוט ב 28 ו 27. הקוטר הסופי לאחר ליטוש האש צריך להיות בטווח של 5 - 7 מיקרומטר.
3. הכנס פיפטת גירוי במחזיק מיקרואלקטרודות המחובר למזרק.

3. הקלטות חשמליות של זרמי צומת מעוררים (EJCs)

1. הקלטה
   1. הניחו את צלחת הפטרי עם ההכנה על שלב המיקרוסקופ (איור 2). הכנס את אלקטרודת הייחוס לאמבטיה.
   2. מלא את אלקטרודת ההקלטה בתמיסת HL3. תחת המטרה של 10x (ראו טבלת חומרים), טבלו את האלקטרודה לתוך האמבטיה והניחו אותה על שרירים 6 ו-7 של מקטעי הבטן 2, 3 או 4 באמצעות המיקרומניפולטור (ראו טבלת חומרים) (איור 3, A.1 ו-A.2).
   3. החלף את המטרה ל- 60x (ראה טבלת חומרים). התמקדו בתחום העניין באמצעות אופטיקה אפי-פלואורסצנטית או DIC. הניחו את קצה האלקטרודה על גבי הבוטון הסינפטי (איור 3 B.1-3).
   4. לחץ את האלקטרודה בעדינות רבה על השריר. לחץ מוגזם עלול לפגוע בצומת העצבית-שרירית (NMJ) או לגרום לעלייה בפעילות סינפטית ספונטנית. ודאו שקצה האלקטרודה אינו סתום - אם כן, החליפו אותו.
   5. הפעל את המגבר, את לוח המיזוג ואת המחשב.
   6. בחר את מצב מהדק המתח במגבר.
   7. התחל לרכוש תוכנה ובחר במצב 'ללא פערים'.
   8. שימו לב להופעתם של זרמי צומת מעוררים מיניאטוריים (mEJCs) על מסך המחשב.
   9. ודא כי המשרעת של mEJCs היא בטווח של 0.2 - 0.7 nA.
      הערה: EJCs קטנים יותר מצביעים על כך שלאלקטרודת ההקלטה יש פגמים או שהיא אינה ממוקמת כראוי.
2. גירוי
   1. באמצעות מיקרומניפולטור, תחת שליטה חזותית, מניחים את אלקטרודת הגירוי ליד האקסון המעצבב קטעי בטן 2 - 4.
   2. הפעילו לחץ שלילי על-ידי משיכת הבוכנה של המזרק המחוברת למחזיק האלקטרודה כך שהאקסון יימשך לתוך האלקטרודה (איור 2).
   3. הפעל את המגרה. סובבו את הידית על יחידת הבידוד (ראו טבלת חומרים) כדי לקבוע זרם אפס, ולאחר מכן הגדילו אותה בעדינות עד להופעת EJCs (או עד שמגיעים לסף).
   4. בצע את הגירוי במשטר suprathreshold, כאשר זרם הגירוי גדל בערך פעמיים, בהשוואה לסף לתצפית של EJCs.
      הערה: מניסיוננו, עוצמת גירוי כזו היא אופטימלית כדי למנוע כשלים פוטנציאליים לפעולה וירי פוטנציאלי לפעולה. לדוגמה, אם EJCs מופיעים בזרם גירוי של 0.2 mA, השתמש בזרם של 0.4 mA לאורך כל הניסוי.

תוצאות

איור 1. שלבים אחרונים של ייצור micropipette. (A) קצות אלקטרודות לאחר משיכה וליטוש אש. (ב.1) ההגדרה לכיפוף חוד. (B.2) שטח הקופסה מוצג מוגדל מימין. האלקטרודה וחוט הלהט קבועים כך שקצה האלקטרודה ממוקם מעט מעל החוט ולא נוגע. (C.1) אלקטרודת ההקלטה. (C.2) שטח הקופסה מוצג מוגדל מימין. לכיפוף הראשון זווית של כ-90°, והמרחק בין...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרולפיד 1WG61	גריינר	1WG61	מיקרולפיד
אולימפוס BX61WI	אולימפוס	BX61WI	מיקרוסקופ זקוף
אולימפוס Lumplan FL N 60x	אולימפוס	UPLFLN 60X	מטרת מיקרוסקופ 60X
אולימפוס UPlan FL N 10x	אולימפוס	Uplanfl N 10X	מטרת מיקרוסקופ 10X
Narishige Micromanipulator	נארישיגה	MHW-3	מיקרומניפולטור הידראולי מים תלת צירי
npi GmbH אלקטרוני ELC-03XS	npi GmbH אלקטרונית	ELC-03XS	מגבר אלקטרופיזיולוגי
א.מ.פ.י מאסטר 8	א.מ.פ.י.	מאסטר 8	ממריץ חשמלי
א.מ.פ.י איזו-פלקס	א.מ.פ.י.	איזו-פלקס	מבודד גירוי
טבלת TMC נגד רטט	TMC	63-9090	טבלה נגד רעידות
כלוב TMC פאראדיי	TMC	81-333-90	כלוב פאראדיי
Digidata 1322A	מכשירי אקסון	Digidata 1322A	דיגידאטה
מחשב	Dell	דגם Dimension 5150 של Dell	מחשב עם מערכת הפעלה Win XP
מחזיק אלקטרודה	WPI	MEH3SW	מחזיק אלקטרודה
מסנן אופטי	אומגה אופטי	XF 115-2	קוביית סינון לזיהוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)
pCLAMP 8	מכשירי אקסון	8.0.0.81	תוכנה להקלטת אותות
קוונטן	תוכנה פנימית	-	תוכנה לעיבוד אותות
קנטון-S (Wildtype)	בלומינגטון סטוק סנטר	64349	קונטרול פליי ליין
cpx SH1	מתנה נדיבה של ג'יי טי ליטלטון	-	Complexin נוק-אאוט קו זבוב עם אקסוציטוזה ספונטנית מוגברת
CD8-GFP	בלומינגטון סטוק סנטר	5137	קו זבוב עם תג פלואורסצנטי עצבי (GFP)