$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. הגדרת מערכת
- בנה את יחידת בקרת הלחץ.
- הרכיבו את יחידת בקרת הלחץ בהתאם למפת המעגלים (איור 1). הלחמתו את החלקים הדרושים למעגל המודפס (PCB) המיוצר בהתאם לסכמות המעגלים החשמליים (איור 1b). השתמש בנגדים סטנדרטיים, נורות LED (דיודות פולטות אור), טרנזיסטורים של אפקט שדה (MOSFETs) של מוליכים למחצה של תחמוצת מתכת, קבלים ומחברים. הלחמת שסתומי סולנואיד על לוח המעגלים המודפסים (PCB). חבר את משאבת האוויר וחיישן לחץ האוויר ללוח המעגלים המודפסים באמצעות חוט חשמל.
הערה: לאחר שכל החלקים הדרושים זמינים, יש לבנות את יחידת בקרת הלחץ תוך כשעתיים.
- חבר את לוח רכישת הנתונים המשני (DAQ).
- חבר את פלטי הנתונים מלוח המעגל המודפס ללוח DAQ, לפי טבלה 1.
הערה: לוח DAQ יפעל ב"מצב חד-צדדי". מפת היציאה מופיעה במדריך למשתמש (עיין בטבלת החומרים).
- חבר את "AIn Pr S" לאחד מערוצי הקלט האנלוגי (AI) ואת "R-Gr" לאחד העילות האנלוגיות בלוח DAQ המשני.
- חבר את הפלט הראשי מהמגבר לאחד מערוצי הבינה המלאכותית ואת הקרקע לקרקע האנלוגית של לוח DAQ המשני.
הערה: ניתן להשתמש בכבל BNC סטנדרטי כדי לחבר את הפלט הראשי מהמגבר.
- הפשיט את הקצה השני וחבר את האות החיובי (כלומר ליבת נחושת) לערוץ הבינה המלאכותית ואת הקרקע (כלומר החוט הדק סביב הליבה) לקרקע האנלוגית. חזור על שלב זה עבור ערוץ שני אם נעשה שימוש ביותר מערוץ תיקון אחד.
הערה: הקלט האנלוגי ללוח DAQ יוגדר בשלבים מאוחרים יותר.
- חבר את החשמל לתפוקת החשמל של לוח DAQ המשני. השתמש במקור מתח נפרד של 12 וולט עבור המשאבה.
- חבר את הצינורות.
- חבר את משאבת האוויר ואת שני השסתומים.
- בשלב האחרון, השתמש במחבר תלת-כיווני כדי לחבר את הצינור הרך מהיציאה העליונה של שסתום 2 לחיישן הלחץ ולמחזיק הפיפטה.
- אם משתמשים בשתי פיפטות יש להוסיף מחבר תלת-כיווני נוסף לצינור המחובר למחזיק הפיפטה. בעת תיקון, לעבור באופן ידני בין השסתומים ואת פיפטות בשימוש.
- התקן Autopatcher IG.
הערה: דרישת מערכת: Autopatcher IG נבדק רק במחשב שבו פועל Windows 7. הוא לא אומת עבור מערכות הפעלה אחרות. ההליך המתואר חל באופן ספציפי על החומרה המפורטת בטבלת החומרים.
- הורד את Autopatcher-IG מ- GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
- התקן את Python (עיין בטבלת החומרים עבור הגרסה וכתובת ההורדה).
- הסר את ההתקנה של ספריית PyQt4 על-ידי הקלדת "pip uninstall PyQt4" בשורת הפקודה terminal.
הערה: המערכת משתמשת בגרסה ישנה יותר של ספריית PyQt4 כדי להשיג תאימות לספריות Qwt ו- Opencv.
- התקן ספריות Python מקבצי גלגל היסטוריים (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). חפש את הקבצים הבאים: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) ו- Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- כדי להתקין את קבצי הגלגל, עבור לספרייה שבה נשמרים הקבצים והקלד "pip install ***wheelfilename***.whl." החלף את "***wheelfilename***" בשם האמיתי של הקובץ.
הערה: "cp27" בשם קובץ הגלגל מציין Python 2.7, ו- "win32" מציין Windows 32 סיביות. אם "win32" לא עובד, נסה "win64".
- כדי לשלוט במצלמת CCD (התקן עם מצמדי טעינה), הורד והתקן את תוכנית ההתקנה עבור 64 סיביות (https://www.qimaging.com/support/software/). לאחר מכן הורד את MicroManager עבור 64 סיביות (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) כדי לשלוט במצלמה ב- Python.
- כדי לשלוט במניפולטורים ובשלב המיקרוסקופ, התקן תוכנת בקרה שסופקה על ידי היצרן.
הערה: על ידי כך, הנהג הדרוש כדי לשלוט מניפולטורים מותקן גם. חבילת ההתקנה מסופקת בדרך כלל בתקליטור.
- כדי לשלוט בלוח DAQ המשני, התקן את הספרייה האוניברסלית מתקליטור, שסופק עם רכישת לוח DAQ.
- הגדר את החומרה עבור Autopatcher IG.
- חבר את במת המיקרוסקופ ובקרי המניפולטור למחשב באמצעות יציאות USB.
- הקצה מספרי יציאות COM ליחידה 0: שלב המיקרוסקופ, יחידה 1: מניפולטור שמאלי ויחידה 2: מניפולטור ימני, בסדר זה, בקובץ התצורה "ports.csv" בתיקייה "תצורה". השאר את שאר הפרמטרים בקובץ ports.csv (כלומר "SCI" ו- "1") ללא שינוי.
הערה: ניתן למצוא את פרטי מספר יציאת COM על-ידי הפעלת תוכנת קביעת התצורה של המניפולטור שסופקה על-ידי היצרן. עבור אל הכרטיסייה "הגדרות", בחר "הגדרות" ואת הדף "תנועה", וקרא את התוויות עבור כל כרטיסייה בחלק העליון. לחלופין, ניתן למצוא מידע זה במנהל ההתקנים של המחשב.
- הקצה מספרי ערוצי קלט אנלוגיים בלוח DAQ עבור חיישן לחץ וערוץ תיקון 1 ו- 2 (המתאים ליחידה 1 ו- 2). הזן את מספר הערוץ בקובץ "DAQchannels.csv" בתיקייה "configuration".
הערה: מומלץ לפתוח את קבצי .csv באמצעות היישום 'פנקס רשימות' במקום גיליון אלקטרוני, מכיוון שהוא עשוי לשנות את המידע בעת שמירת שינויים.
- הפעל את Autopatcher IG.
- הפעל את המגבר, בקר המיקרוסקופ ובקר המניפולטור. ודא שתוכנת המגבר פועלת.
- הפעל Autopatcher IG עם Python ממסוף שורת הפקודה באופן הבא: ראשית, שנה את הספרייה (הפקודה "cd" עבור רוב המסופים הנפוצים) שבה מותקן Autopatcher IG, הקלד "python Autopatcher_IG.pyw" במסוף שורת הפקודה ולחץ על מקש "Enter".
הערה: אל תפעיל את תוכנת בקרת המניפולטור לפני הפעלת Autopatcher IG מכיוון שהיא תתפוס את שלב המיקרוסקופ והמניפולטור, ותגרום ל- Autopatcher IG לא להיות מסוגל למצוא את החומרה. ניתן להפעיל תוכנת בקרת מניפולטור לאחר הפעלה מלאה של Autopatcher IG אם ישנם מודולים נוספים שיש לשלוט בהם (למשל, מחמם מוטבע).
- כיול פיפטה ראשית.
- משוך פיפטות טלאי. ממלאים פיפטת זכוכית משוכה בתמיסה פנימית ומעמיסים אותה על במת הראש.
הערה: לפיפטות זכוכית ריקה יש ניגודים שונים מתחת למיקרוסקופ והן עלולות להוביל לכיול לא מדויק.
- הזיזו את קצה הפיפטה לשדה הראייה של המיקרוסקופ והביאו אותו למיקוד. אם לוח החיוג משמש להזזת שלב המניפולטורים ו/או המיקרוסקופ, עדכן את הקואורדינטות על ידי לחיצה על "z" במקלדת.
הערה: פעולה זו אינה הכרחית אם המקלדת (שלב המיקרוסקופ: A / D - ציר x, W / S - ציר y, R / F - ציר z; מניפולטורים: H / K - ציר x, U / J - ציר y, O/L - ציר z, 1/2 - מספר יחידה) משמש לשליטה בתנועה מכיוון שהקואורדינטות יעודכנו בזמן אמת.
- לחץ על הלחצן "התחל כיול" בממשק המשתמש הגרפי הראשי (GUI) עבור היחידה המתאימה שעליה נטענת פיפטה (איור 2).
הערה: חלון מוקפץ יופיע בסיום הכיול.
הערה: הכיול יתבצע באופן אוטומטי, אשר ייקח בערך 3.5 דקות. לחיצה על אותו כפתור (שעבר כעת ל"ביטול כיול" לאחר הפעלת הכיול) תבטל את ניסיון הכיול.
- שמור את הכיול על ידי לחיצה על "שמור כיול" בתחתית ממשק המשתמש הגרפי הראשי (הוא שומר את הכיול הנוכחי עבור שני המניפולטורים וניתן לטעון אותו בעתיד).
הערה: שדה הראייה תחת הגדלה נמוכה (4 או 10X) וגבוהה (40X) חייב להיות מיושר כדי שהכיול המשני יפעל כראוי. עיין במדריך למשתמש של המערכת האופטית בשימוש עבור הליכי היישור.
2. הליך מהדק תיקון אוטומטי
- הכינו פרוסות מוח חריפות
- הכינו פיפטות זכוכית למהדק המדבקה.
- הניחו פרוסת מוח אחת במרכז תא ההקלטה. ייצבו את הפרוסה בעזרת החזקת פרוסה או "נבל".
- זהה את התא הפלואורסצנטי.
- מצא את תחום העניין מתחת לעדשת 4X. הזז את שלב המיקרוסקופ על ידי הפעלת מצב לחץ כדי לזוז ("CTM") ולחיצה על מרכז אזור העניין. לחלופין, השתמש בלוח המקשים כדי להזיז את שלב המיקרוסקופ (A/D - ציר x, W/S - ציר y, R/F - ציר z).
- עבור לעדשת ההגדלה הגבוהה וכוונן את המיקוד על ידי הזזת המיקרוסקופ בציר z, באמצעות R/F בלוח המקשים.
הערה: מומלץ לכוונן את מפלס אמבט המים כך שמישור המוקד מתחת לעדשות בהגדלה נמוכה וגבוהה יהיה זהה או דומה בציר z.
- לחץ על הלחצן "זהה תא" בעמודה הראשית של ממשק המשתמש הגרפי, "יחידה 0". אם לא ניתן לשלוט במקור אור ה-LED או הלייזר של ההתקנה על-ידי אות TTL, הפעל ידנית את נורית ה-LED/לייזר; חלון מוקפץ יופיע בסיום זיהוי התא.
- כבה את נורית ה- LED/לייזר במידת הצורך; רשימה של קואורדינטות תאים תופיע בממשק המשתמש הגרפי "מיקומי זיכרון". הסר תאים לא רצויים מהרשימה על ידי לחיצה על כפתור "X" ליד הקואורדינטות.
- לחלופין, אם תאי היעד אינם מסומנים באופן פלואורסצנטי, לחץ על "מצב עכבר" בממשק המשתמש הגרפי הראשי. לחץ על התא המעניין; נקודה צהובה עם מספר תופיע על התא, והקואורדינטות של התא יופיעו בממשק המשתמש הגרפי "מיקומי זיכרון".
- כיילו את פיפטה המשנית.
- ממלאים 1/3 פיפטה מזכוכית בתמיסה פנימית. מעמיסים את הפיפטה על מחזיק הפיפטה המחובר לשלב הראש.
- השתמש בעדשה בהגדלה נמוכה. הכנס את פיפטה לשדה הראייה וכוונן את המיקוד באמצעות לוח המקשים (H/K - x-axis, U/J - y-axis, O/L - z-axis). השתמש ב- "1" וב- "2" כדי לעבור בין יחידה 1 ליחידה 2.
- טען את הכיול הראשי על ידי לחיצה על "טען כיול". לחץ על כפתור "כיול משני" בממשק המשתמש הגרפי הראשי מתחת ליחידה שבשימוש. לדוגמה, אם יחידה 2 נמצאת בשימוש, לחץ על הלחצן "כיול משני" בעמודה "יחידה 2". בצע את הוראות החלון המוקפץ כדי לעבור לעדשת ההגדלה הגבוהה.
- תיקון תא יעד.
- ודא שתוכנת "MultiClamp" (כלומר מגבר) פועלת. לחץ על כפתור "בקרת תיקון" כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי "בקרת תיקון"; פתיחת ממשק משתמש גרפי זה עשויה להימשך עד מספר דקות.
- השתמש בעדשת ההגדלה של 40X על ידי סימון "40X" בעמודה הראשית של ממשק המשתמש הגרפי "יחידה 0". לחץ על כפתור "עבור אל" ליד התא המעניין ברשימת הקואורדינטות בממשק המשתמש הגרפי "מיקום זיכרון"; המיקרוסקופ יעבור לתא.
- לחץ על כפתור CTM של היחידה בשימוש בממשק המשתמש הגרפי הראשי כדי לאפשר תנועה לאחר לחיצת עכבר. לחץ על התא המעניין; קצה פיפטה יעבור לתא.
- לחץ על כפתור "תיקון" על "בקרת תיקון" GUI.
הערה: תיקון אוטומטי יתחיל, וניתן לפקח על הלחץ וההתנגדות בממשק המשתמש הגרפי "בקרת תיקון".
- השתמש בלחצן "יחידה 1 שנבחרה" כדי להחליף את אות הקלט בין שתי היחידות.
הערה: המערכת תתקרב לתא היעד, תפעיל לחץ שלילי, תתאים לפוטנציאל קרום התא ותזהה היווצרות ג'יגזיאלית על סמך סדרה של ספי לחץ והתנגדות ולוגיקה.
- תמרן את התהליך האוטומטי בכל שלב על ידי לחיצה על הלחצנים המתאימים בממשק המשתמש הגרפי "פקד תיקון". לדוגמה, לחץ שוב על כפתור "תיקון" כדי לבטל את ניסוי התיקון ולחץ על "השלב הבא" כדי לקדם את תהליך התיקון לשלב הבא, ללא קשר לסף.
הערה: חלון קופץ יודיע למשתמש כאשר נוצר ג'יגאזל, ותוצג האפשרות להחיל zap יחד עם לחץ שלילי גדול.
- בחר "כן" כדי לפרוץ פנימה עם zap ו יניקה משולבים. לחלופין, בחר "לא" כדי לפרוץ פנימה עם שאיבה בלבד.
הערה: כאשר תיקון מוצלח של תא שלם הושלם, חלון מוקפץ יזכיר למשתמש לשמור את יומן התיקונים של הניסוי.
- שמור את יומן תיקון הניסוי.
הערה: אם גירסת ניסיון לתיקון נכשלת, חלון מוקפץ יודיע למשתמש ותהליך התיקון יתאפס.
- חזור לשלב 2.4 וחזור על השלבים עם תא אחר.