הקלטה אלקטרופיזיולוגית מעצבי המעי הגס במעי הגס Ex Vivo Rat

תקציר

מקור: Meng, Y. et al., אפיון חוץ גופי של התכונות האלקטרופיזיולוגיות של סיבי המעי הגס בחולדות. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים שיטה לתיעוד הפעילות של עצבי המעי הגס במעי גס של חולדה ex-vivo, מקופלים בשני הקצוות ומוחדרים במי מלח כדי להגביר את הלחץ התוך-לומינלי. ככל שהלחץ עולה, האות העצבי עולה, ומציין את הגירוי שלו.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תמיסת זילוח ותרכובות בדיקה

1. הכינו 5 ליטר של תמיסת קרבס: 113 מ"מ נתרן כלורי, NaCl, 5.9 מ"מ אשלגן כלורי, KCl, 1.2 מ"מ די-מימן נתרן פוספט, NaH₂PO₄, 1.2 מ"מ מגנזיום גופרתי, MgSO₄, 25 מ"מ סודיום ביקרבונט, NaHCO₃, 1.2 מ"מ סידן כלורי, CaCl₂ וגלוקוז 11.5 מ"מ. הרוו את התמיסה בתערובת גז 95% O₂ + 5% CO₂. טרום קירור ~ 500 מ"ל של קרבס מחומצן במקרר.
2. הכינו אליציטוטים של תרכובות בדיקת מלאי (1 מ"מ קפסאיצין באתנול ו-10 מ"מ 5-הידרוקסי-טריפטמין (5-HT) במי מלח) לפי הצורך. מדללים את הציר בקרבס (ליישום אמבטיה) ובמי מלח (למתן תוך לומינלי) עד לריכוז הסופי ממש לפני השימוש.

2. הכנת אלקטרודת ההקלטה

1. משוך את אלקטרודת ההקלטה מצינורות זכוכית סטנדרטיים ללא חוטים פנימיים (קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ) באמצעות מושך אלקטרודות קונבנציונלי. התאם את הגדרות המושך לחום ומשיכה כך ששוק האלקטרודות שנמשכו יהיה בין 20 ל -25 מ"מ.

3. איסוף רקמות

1. מרדימים את החולדה עמוק באמצעות נתרן pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג, כלומר p).
2. תוך הקפדה על סטריליות, יש לחשוף את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך בקו האמצע בדופן הבטן באמצעות אזמל. משוך את mesentery ורקמות אחרות הצידה כדי לחשוף את המעי הגס.
3. הניחו את בעל החיים מתחת למיקרוסקופ המנתח. באמצעות דיסקציה זהירה, אתר את גנגליון האגן השמאלי (PG) וזהה את עצבי האגן (PN) ואת העצבים הספלנצ'ניים המותניים (LSN) המצטרפים אליו. חתכו את העצבים האלה במרחק של כמה מילימטרים מה-PG.
   הערה: ה-PG נמצא קרוב לצומת המעי הגס. בדרך כלל, 3-4 PN מחוט השדרה המותני ופרויקט LSN ל-PG (איור 1).
4. חותכים את עצם הסימפיזיס כדי לחשוף את פי הטבעת. הסר את הרקמות (כלומר, שלפוחית השתן, וכו ') מעל המעי הגס; היזהר להשאיר את PG שלם.
5. להקריב את החולדה על ידי הזרקה תוך ורידי של מנת יתר של pentobarbital. יש לחצות את המעי הגס כ-3 ס"מ מעל ה-PG ולהסיר את המעי הגס מהחיה באמצעות מלקחיים.
6. מעבירים את הקולורקטום לצלחת פטרי מלאה בתמיסת קרבס מקוררת מראש. הסר את הצואה על ידי שטיפה עדינה של המעי הגס. הסר את שאריות שלפוחית השתן ורקמות אחרות בזהירות, מבלי לסכן את PG.

4. דיסקציה של עצבי המעי הגס

1. הכניסו את המעי הגס לתא הקלטה (20 מ"ל) וחוררו את הרקמה ברציפות בתמיסת קרבס קרבוגנית. הגדר את קצב הזילוח על 15 מ"ל/דקה.
2. לערבב את המעי הגס הן בקצה הפה והן בקצה פי הטבעת. התחל את העירוי intraluminal של המעי הגס עם מלוחים בקצב של 10 מ"ל / שעה בכיוון הפה אנאלי.
3. אתר את ה-PG העיקרי תחת המיקרוסקופ המנתח. השתמש בסיכות חרקים כדי לחשוף את הגנגליון. בדיסקציה זהירה מצאו ענף דק של עצב שמקורו בגנגליון ורץ לכיוון המעי הגס (איור 1). חותכים את העצב קרוב לגנגליון .
   הערה: איור 1 מדגים הקלטה מענף עצבי דיסטלי ל-PG. העצב מכיל ככל הנראה תערובת של סיבי אגן וסיבי afferent מותניים. לחלופין, ניתן לבצע הקלטה מה-PN ו/או מה-LSN הפרוקסימלי ל-PG.
4. הפעל את אמבט החימום וחמם את תמיסת קרבס כדי לשמור על טמפרטורת החדר ב 34 ± 0.5 מעלות צלזיוס.

5. הכנת אלקטרודת היניקה

1. קחו פיפטת זכוכית שנמשכה מראש (שלב 2) ובדקו אותה תחת המיקרוסקופ המנתח. שברו את קצה האלקטרודה עם זוג מלקחיים, כך שהיא בגודל התואם לקוטר העצב שיירשם.
2. שיקוע הקצה על-ידי הצבתו קרוב לקרני אור בהירות יותר.

6. הקלטה אלקטרופיזיולוגית

1. חבר את האלקטרודה המשופעת למחזיק האלקטרודה. חבר מזרק של 10 מ"ל ליציאה הצדדית במחזיק כדי להפעיל לחץ שלילי או חיובי על האלקטרודה.
2. חבר את המחזיק לראש הבמה של המגבר הביולוגי והרכיב את במת הראש על מניפולטור.
3. העבירו את האלקטרודה לאמבט הרקמה ומלאו את האלקטרודה בתמיסת קרבס על ידי הפעלת יניקה עדינה עד שהיא באה במגע עם חוט הכסף של המחזיק. מקם את קצה האלקטרודה קרוב לקצה החתוך של העצב ומפעיל לחץ שלילי כדי למצוץ את העצב לתוך האלקטרודה. הפעל לחץ שלילי יותר, כך ~ 1 מ"מ של העצב נמשך לתוך האלקטרודה ויוצר אטימה הדוקה.
4. הפעל את המגבר הביולוגי והגדר את המסנן ל- 300 - 3,000 הרץ. עקוב אחר האות באוסילוסקופ ורשום את האות העצבי (קצב דגימה של 20 קילוהרץ) ואת אות הלחץ התוך לומינלי (קצב דגימה של 100 הרץ) באמצעות מחשב עם תוכנת עיבוד נתוני ספייק.

7. בדיקת רגישות המעי הגס

1. יש למרוח את התנפחות המעי הגס על ידי סגירת הברז התלת-כיווני על צינורית המוצא תוך כדי עירוי רציף תוך לומיני. עקוב אחר הלחץ התוך לומינלי עד שהוא מגיע ל -60 מ"מ כספית, ואז פתח את הברז המשולש על צינורית הניקוז.

תוצאות

איור 1. הקלטה אלקטרופיזיולוגית של עצבי המעי הגס של חולדה במבחנה. א. איור סכמטי של הכנת המעי הגס "צינור" ex vivo של החולדה. הקולורקטום, עם ה-PG המחובר, מאוחה בתא ההקלטה ומשומר בשני קצותיו. עירוי intraluminal מושגת באמצעות משאבת מזרק ונע בכיוון הפה אנאלי. התנפחות המעי הגס מתבצעת על ידי סגירת הברז המשולש (d) על צינורית היציאה. ענף עצבי עדין מה-PG נחתך ונרשם באמצעות אלקטרודת ינ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן Pentobarbital	שנחאי ווסטאנג ביו-טק	B558
קפסאיצין	סיגמא	M2028
מושך אלקטרודות	מכשיר MicroData Inc	PMP107
מערכת נוירולוגית (Bioamplifier)	Digitimer, בע מ	מערכת נוירולוגית
ממיר A/D	קיימברידג' עיצוב אלקטרוני	מיקרו1401
תוכנה לעיבוד נתונים	קיימברידג' עיצוב אלקטרוני	ספייק2 גרסה 6
חוט כסף	מכשירים מדויקים בעולם	EP12
צינורות זכוכית	מכשירים מדויקים בעולם	1ב150-4
מחזיק אלקטרודה	מכשירים מדויקים בעולם	MEH3SBW
אמבט חימום	גרנט	GR150
מיקרוסקופ מנתח	לייקה	Zoom2000
מיקרוסקופ מנתח	מכשירים מדויקים בעולם	PZMIII-BS
מצית סיגריות	כלשהו	נה
כלי ניתוח	מכשירים מדויקים בעולם	נה
סיכות חרקים	תוצרת בית מחוט נירוסטה 0.1 מ"מ	נה
מניפולטור תלת כיווני	מכשירים מדויקים בעולם	KITF-R
חולדות	כלשהו	נה	ניתן להשתמש בכל זן/מין.