הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי בתאי אנדותל כלי דם מוחיים

Abstract

מקור: Rellick, S. L. et al. הערכת תפקוד ביואנרגטי בתאי אנדותל כלי דם מוחיים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הערכת התפקוד המיטוכונדריאלי של תאי אנדותל כלי דם מוחיים (CVE) באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאי. תאי CVE מצופים בלוח תרבית תאי שטף חוץ-תאי. חיישני שטף חוץ-תאיים עוברים הידרציה לפני טעינה וכיול לתוך הביואנלייזר. הלוח המכיל תאים נטען לאחר מכן לניתוח.

Protocol

1. זרע וטיפול בתאי אנדותל כלי דם מוחיים (CVE) על צלחות תרבית תאים

1. תאי CVE זרעים (bend.3 cells) על צלחת תרבית תאי שטף חוץ-תאי של 96 בארות: 80 μL/well. הניחו את צלחת תרבית התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO₂ של 5%. הערה: 16 × 10³ תאים לכל באר יגיעו למפגש של 60 - 80% תוך 24 שעות.
2. אם התאים נחשפים לכימיקל, הוסף את הטיפולים ברגע שהתאים מחוברים לתחתית הצלחת (8 - 24 שעות לאחר הזריעה).
   הערה: לניסויי טרנספקציה, אין להוסיף אנטיביוטיקה במדיום גידול שלם.

2. הערכת תפקוד המיטוכונדריה באמצעות הביואנלייזר

1. לפני תחילת הבדיקה, יש ללחלח מחסנית חיישן שטף חוץ-תאי עם כיול על ידי הוספת 150 μL של תמיסת כיול שטף חוץ-תאי לצלחת ולדגור למשך הלילה ב-37°C ללא CO₂.
2. באמצעות תחנת שטיפת הצלחות, שנה את מדיום תרבית התאים למדיום בדיקת שטף חוץ-תאי pH 7.0. לדגור על התאים ב 37 ° C ללא CO₂ במשך 30 - 60 דקות.
3. הכינו תמיסות עבודה של 8 מיקרומטר אוליגומיצין, 4.5 מיקרומטר קרבונילציאניד 4-(טריפלואורומתוקסי) פנילהידראזון (FCCP), 10 מיקרומטר רוטנון ו-10 מיקרומטר אנטימיצין A בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM). טען 25 μL של פתרונות מלאי לתוך יציאות הזרקת מחסניות: יציאה A, oligomycin; יציאה B, FCCP; יציאה C, רוטנון ואנטימיצין A עם מדיום בדיקת שטף חוץ-תאי. יישם את פרוטוקול הבדיקה כמתואר בטבלה 1.
4. טען את המחסנית hydrated לתוך bioanalyzer ולבצע את הכיול על ידי לחיצה על כפתור "התחל". לאחר השלמת הכיול, הסר את הלוח התחתון של המחסנית וטען את לוחית התא על ידי לחיצה על הפקודה "בטל את המחסנית". המשך את הבדיקה עד להשלמת כל המדידות.
5. פתח את קובץ הנתונים וקבל את ערכי הקצב מהביואנלייזר. יצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני.

טבלה 1. פרוטוקול הפעלת המכשיר.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
bend.3 קו תאים	ATCC	CRL-2299	25-30 קטעים
מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)	ATCC	30-2002
סרום בקר עוברי	אטלנטה ביולוגיה	S12450	10% בגמר
פניצילין/סטפטומיצין	היקלון	SV30010	1×100 גרביים
0.25% טריפסין 0.03% תמיסת EDTA	קורנינג	25-053-CI
נתרן פירובט	קורנינג	25-000-CI	1.0 מיקרומטר סופי
גלוקוז	סיגמא	CAS 50-99-7	25 מ"מ בגמר
אוליגומיצין	סיגמא	O4876	1.0 מיקרומטר סופי
קרבונילציאניד 4-(trifluoromethoxy) פנילהידראזון (FCCP)	סיגמא	C2920	0.5 מיקרומטר סופי
רוטנונה	סיגמא	₪2200	1.0 מיקרומטר סופי
אנטימיצין A	סיגמא	CAS 1397-94-0	1.0 מיקרומטר סופי
תחנת שטיפת פלטות	סוסון ים Bioscience
ביואנייזר שטף חוץ-תאי	סוסון ים Bioscience	XFe96
צלחת תרבית תאי שטף חוץ-תאי	סוסון ים Bioscience	102416-100
מחסנית חיישן שטף חוץ-תאי	סוסון ים Bioscience	102416-100
פתרון כיול שטף חוץ-תאי	סוסון ים Bioscience	100840-000
מדיום בדיקת שטף חוץ-תאי	סוסון ים Bioscience	102365-100	PH חוצץ לפני הבדיקה