הקלטה של פעילות עצבית רגשית מזנטרית במקטע ג'ג'ונום של עכבר ex vivo

תקציר

מקור: Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מראה את התהליך של רישום אותות חשמליים מעצבי afferent mesenteric במקטע jejunal עכבר מנותח כדי לחקור את ההשפעות של לחץ רקמות ושינויים בתנועה על פעילות עצבית afferent.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת עצב afferent jejunal

1. לבצע המתת חסד של מכרסם מתבגר או מכרסם בוגר שאושרה לפני הניסוי על ידי הוועדה האתית המקומית (למשל, טשטוש סופני ואחריו ניקור לב, נקע צוואר הרחם וכו ').
   הערה: השתמשנו בנקע צוואר הרחם כדי להקריב את בעלי החיים, וכך נוצרו ניסויים ללא צורך בהרדמה נוספת או טיפול לאחר הניתוח מכיוון שהרקמות מעובדות עוד יותר במבחנה.
   הערה: הוכח כי גיל מחליש תפקודים מכנו-חושיים מזנטריים, ולכן אנו ממליצים לחוקרים לדבוק בקבוצת גיל מסוימת למשך ניסוי יחיד.
2. הניחו את חיית המעבדה שהוקרבה במצב שכיבה ובצעו חתך בקו האמצע של הבטן דרך העור ושכבת שרירי הבטן באמצעות אזמל, המשתרע מתהליך הקסיפואיד ועד עצם הערווה.
3. יש לרחוץ את חלל הבטן בתמיסת קרבס קרה על מנת למנוע מהרקמות התוך בטניות להתייבש (הרכב קרבס: 120.03 mM NaCl, 6.22 mM KCl, 1.57 mM NaH₂PO₄, 15.43 mM NaHCO₃, 1.21 mM MgSO₄, 11.52 mM D-glucose ו-1.52 mM CaCl₂).
4. הבלו במהירות את כל הג'ג'ונום באמצעות מספריים חדים על ידי כריתה של כ -20 ס"מ של המעי הדק החל מיד מפלקס duodenojejunal, תוך הקפדה שלא לפגוע במבנים שמסביב ושמירה על מזנטריית המעי, המכילה כלי דם jejunal ועצבים afferent, שלם.
   הערה: עבור דיסקציה jejunal בלבד בחלל הבטן, אחד לא צריך להשתמש סטריאומיקרוסקופ, כמו זה ניתן לדמיין בקלות בעין בלתי.
5. מניחים את הג'ג'ונום הנכרת בתמיסת קרבס קרה כקרח ושומרים אותו על קרח תוך חמצון רציף של תמיסת קרבס בקרבוגן (95% O₂, 5% CO₂).
6. חותכים את הג'ג'ונום במספריים חדים בלולאות באורך של כ-3 ס"מ. שימו לב לצרור המזנטרי המכיל את כלי הדם ואת העצב הספלנצ'ני איפשהו ליד מרכז הלולאה המתאימה.
7. יש לשטוף כל מקטע בתמיסת קרבס באמצעות קטטר קהה להסרת תוכן לומינלי וכימה, שכן אלה מכילים אנזימי עיכול שיאיצו את הידרדרות דגימת הרקמה במבחנה.
   הערה: היזהר לא לפגוע לומן של הלולאה במהלך שטיפה, כמו הרס של villi יגרום לשחרור של מתווכים שיכולים לשנות את הפעילות העצבית afferent.
8. זהו את המקטע למדידת הפעילות העצבית האפרנטית (למשל, המקטע הג'ג'ונלי הראשון של הרצועה של טרייץ או הכפיפה הדואודנוג'ונלית), והניחו אותו בתא הקלטה ייעודי המצופה בשכבת אלסטומר סיליקון.
   הערה: תחילת הג'ג'ונום מוגדרת אנטומית כחלק המעי הדק שבו הרצועה של טרייץ חוצה את המעי הדק, המכונה גם duodenojejunal flexure.
   הערה: כסו את תחתית תא ההקלטה בשכבת אלסטומר סיליקון דקה זמן רב לפני תחילת הניסוי. הכינו שכבת אלסטומר זו בהתאם להוראות היצרן.
9. יש לנקב את התא ללא הרף בתמיסת קרבס חמה וקרבוגנית בקצב של 10 מ"ל/דקה ולשמור על טמפרטורת הקרבס בתא ההקלטה קבועה על 34°C.
10. הרכיבו את קטע הג'ג'ונל באמבט האיברים, כך שהקצה האוראלי מחובר לדרייבר המזרק המספק זרימה לומינלית, והקצה האבורלי מתחבר לזרם היוצא. מתחו מעט את הקטע אך הקפידו לא להפעיל מתח מוגזם. חבר את שני הקצוות בחוזקה באמצעות חיבורי משי 4/0 ליציאות הכניסה והיציאה.
11. חברו את דרייבר המזרק לקצה הפה, וחוררו את המקטע הג'ג'ונלי תוך לומינלי בתמיסת קרבס (לא מחומצנת, טמפרטורת הסביבה) בקצב של 10 מ"ל/שעה.
12. השתמש בסיכות חרקים כדי להצמיד את המזנטריה של קטע המעי המותקן שטוח לשכבה התחתונה של אלסטומר הסיליקון. למתוח את mesentery החוצה כדי לייעל ויזואליזציה של צרור mesenteric; אין להעמיס על הצרור או על הג'ג'ונום.
13. בצע התנפחות כבש בדיקה (vide infra) על ידי סגירת יציאת הפלט עד שהלחץ התוך-לומינלי של מקטע המעי מגיע ל-60 מ"מ כספית כדי לוודא שאין תמיסת קרבס תוך-לומינלית דולפת מהמקטע המותקן. שימו לב לעלייה חלקה בלחץ האינטרלומינלי ללא הפרעות.
14. שימו לב להתכווצויות קטנות של המקטע (גלים פריסטלטיים) במהלך שלב ההתנפחות הראשונית. במידת הצורך, חסום פעילות פריסטלטית על ידי הוספת 1 מיקרומטר של חוסם תעלות סידן מסוג L nifedipine לתמיסת קרבס.
    הערה: הוספת 1 מיקרומטר של אטרופין לתמיסת קרבס בנוסף לניפדיפין תשתק לחלוטין את קטע המעי.
15. תחת סטריאומיקרוסקופ, להתחיל בעדינות לקלף את רקמת השומן מן mesentery על ידי משיכת אותו בעדינות עם שני פינצטה קטנה, נזהר לא לפגוע בכלי הדם ואת עצב afferent כי לשכב קבור ברקמת השומן.
16. התחילו במרחק מרוחק מהג'ג'ונום, וחשפו את שני כלי הדם בצרור המזנטרי.
17. שימו לב לעצב הג'ג'ונלי האפרנטי בין שני כלי הדם כחוט דק ולבן עטוף ברקמת שומן. יש לנתח רק באופן קרוב יותר לכיוון הג'ג'ונום על ידי קילוף עדין של רקמת השומן באמצעות פינצטה כאשר קשה לזהות ראשונית את שני כלי הדם המזנטריים ו/או את העצב האפרנטי.
18. לנתח את העצב mesenteric jejunal של קטע חופשי על פני מרחק של כמה מילימטרים, על ידי הסרת רקמת השומן דבק עצב.
19. טרנסקט את העצב באמצעות מספריים רקמה חדים. במידת הצורך, קלף את השומן הנותר ואת רקמת החיבור, כמו גם את הנדן האפינוירונלי, על ידי משיכה עדינה עם פינצטה קטנה.
20. באמצעות מיקרומניפולטור, הורידו את קצה אלקטרודת היניקה, המחוברת למזרק עם בוכנה, לתוך אמבט האיברים; לאחר מכן, על-ידי מניפולציה של הבוכנה, שאפו בעדינות תמיסת קרבס מאמבט האיברים, כך שקצה האלקטרודה יהיה שקוע בתמיסת קרבס (איור 1). ודא שתמיסת קרבס מכסה את אלקטרודת התיל בתוך אלקטרודת היניקה.
    הערה: השתמש במושך פיפטה כדי להכין את נימי היניקה מזכוכית בורוסיליקט המכילים את אלקטרודת התיל לפני תחילת הניסוי.
21. מקם את קצה אלקטרודת היניקה מיד ליד גדיל העצב הטרנסקטנטי ומשוך את גדיל העצב הטרנסקט לתוך הנימים לכל אורכו.
22. תמרנו את קצה האלקטרודה לכיוון רקמת שומן כלשהי ושאפו זאת לתוך נימי הזכוכית תוך שאיפה חזקה עם הבוכנה, ובכך "אטמו" מכנית את העצב בנימי התוכן של אמבט האיברים.
23. אמת את ההקלטה של פעילות עצבית afferent באמצעות מערכת רכישת הנתונים, למשל, על ידי ביצוע עלייה הנגרמת על ידי התנפחות רמפה בירי afferent (vide infra). לאחר בידוד העצב לתוך אלקטרודת היניקה, יש לייצב את ההכנה למשך 15 דקות על מנת לקבל מצב יציב של פעילות עצבית ספונטנית לפני ביצוע הניסויים בפועל.
24. כדי לבצע התנפחות רמפה, לנתק את קטע המעי על ידי סגירת יציאת הפלט, מה שמוביל לעלייה הדרגתית בלחץ (עד 60 מ"מ כספית). בצעו את פרוטוקול הניסוי הרצוי רק כאשר שלוש התנפחות רמפה רצופות (עם מרווח של 15 דקות) מניבות פריקה מרובת יחידות הניתנת לשחזור (איור 2).

תוצאות

איור 1: סקירה סכמטית של תא ההקלטה ואלקטרודת היניקה הייעודיים. סקירה מפורטת של ההתקנה הטכנית עם אלקטרודת היניקה ותא ההקלטה במקום.

איור 2: מעקב מייצג אחר הקלטה חוץ גופית של פעילות עצבית ג'ג'ונלית. הקלטה אופיינית של פעילות עצבית ג'ג'ונלית רב-יחידתית (imp....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי (NaCl)	VWR כימיקלים	2,78,10,295	פתרון קרבס מורכב
אשלגן כלורי (KCl)	Acros אורגני	196770010	פתרון קרבס מורכב
נתרן דימימן פוספט (NaH2PO4)	VWR כימיקלים	1,06,34,61,000	פתרון קרבס מורכב
סודיום ביקרבונט (NaHCO3)	מרק	1,06,32,91,000	פתרון קרבס מורכב
מגנזיום גופרתי (MgSO4)	מרק	1,05,88,61,000	פתרון קרבס מורכב
סידן כלורי (CaCl2)	מרק	2,38,11,000	פתרון קרבס מורכב
D-גלוקוז	VWR כימיקלים	1011175P	פתרון קרבס מורכב
מים מזוקקים			פתרון קרבס מורכב
צינורות PVC	ציוד מעבדה מדעית		קטע המעי צריך להיות מותקן מעל צינורות PVC
צינורות סיליקון	ציוד מעבדה מדעית		שאר הצינורות, באופן אידיאלי על בסיס סיליקון - פינוי קל יותר של פסולת בצנרת
חוט משי	Pearsall מוגבלת	10B15S220	חיבור המקטע מעל צינורות PVC
מנהל התקן מזרק	מכשיר הרווארד	55-2222	עירוי intraluminal של קרבס
דו-עיני - כולל הגדלה פי 10 באוקולייר	Zeiss STEMI 2000		הדמיה אופטימלית לדיסקציה של עצב afferent
יחידת בקרת שמיכות הומאורמית	מכשיר הרווארד	507214	חימום תא העוגב
אמבט איברים בהתאמה אישית עם תחתית מכוסה סילגארד
תוכנת Spike2			הקלטה וניתוח של הנתונים
סיכות חרקים, 500 חלקים, נירוסטה, קוטר 0.2 מ"מ	Austerlitz סיכות חרק minutiens		דיסקציה של עצב afferent
פינצטה Dumont #5 inox 11cm	מכשיר מדויק עולמי	500341	דיסקציה של עצב afferent
מספריים, קפיץ, 14 ס"מ	מכשיר מדויק עולמי	15905	דיסקציה של עצב afferent
דיגיטמר DB	NL 108T2/10		מתמר לחץ
מיקרומניפולטור	נארישיגה	M-3333	מניפולציה תלת ממדית של אלקטרודת היניקה
מיקרומניפולטור	בלוק מסתובב X-4		מניפולציה תלת ממדית של אלקטרודת היניקה
מיקרומניפולטור	מעמד מגנטי GJ-8		מניפולציה תלת ממדית של אלקטרודת היניקה
מקור אור	Euromex מיקרוסקופים הולנד EK-1		הדמיה אופטימלית לדיסקציה של עצב afferent
מכשיר הקלטה CED 1401			הקלטה של פעילות עצבית afferent
Humbug 50/60Hz מסלק רעשים	Quest מכשירים מדעיים		סילוק רעשי רקע
משאבת עירוי	גיבסון מיניפולס 2		עירוי של תא האיברים שבו הקטע מותקן
מחזיק מיקרואלקטרודות חצאי תאים 1.5 מ"מ	מכשיר מדויק עולמי	MEH2SW	אלקטרודת יניקה לבידוד של סיב afferent
נימי זכוכית בורוסיליקט, 300 יח'; 1.5/0.84 OD/מזהה	מכשיר מדויק עולמי	1ב150-4	נימים לבידוד של עצב afferent